1、挑后的单菌落（或用 0.1-1.0ml 单菌落的培养物）,接种到 30ml 含有适当抗生素的丰富培养基中（ LB 、 YT 或 Terrific 培养液）,于 37 ℃剧烈振摇下培养过夜.为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养液的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养物应在剧烈振摇下培养.2、在适当的温度和摇速（ 250r/min ）下培养菌液直至对数生长期晚期（ OD600 约为 0.6 ）.3、在 2L 的烧瓶中,将 25ml 对数生长期晚期的菌液接种到含有适当抗生素的 500ml 培养基（ LB 、 YT 或 Terrific 培养液（预热 37 ℃））中.将此培养液在 37 ℃剧烈振摇 (250r/min) 培养约 2.5h .最后的菌液的 OD 值约为 0.4. 不同菌株之间或同一菌株含的质粒不同,细菌的生长速度各不相同,因此为了达到理想的光密度,培养时间可略微长于或短于 2.5h .4、在培养液中添加 34mg/ml 的氯霉素 2.5ml ,使其终浓度为 170ug/ml. 将此培养液与 37 ℃剧烈摇晃下继续以 250r/min 培养 12-16h .5、取部分菌液（ 1-2ml ）到离心管中, 4 ℃贮存备用.余下的菌液于 4 ℃以 2700g （对于 Sorvall GSA 转子时 4100r/min ）离心 15min 收获.弃上清,倒置离心管时的上出.6、用 200ml 冰预冷的 STE 重悬细菌沉淀,按步骤 5 所述重新收集细菌并贮存在 -20 ℃.7、用步骤 6 贮存的 1-2ml 菌液按小量提取法抽提质粒（可使用方案 1 或 4 中的任一种方法）.采用酶切和琼脂糖设置这种对照可能看上去优点过于谨慎,然而它可以避免发生某些可能难以的、浪费大量时间的错误.8、将步骤 6 中冻存的细菌在室温下放置 5-10min 使其解冻后,然后用 10ml 冰预冷的 STET 重悬.将重悬液转移到一个 50ml 的 Erlenmeyer 烧瓶中.10、用夹子夹住 Erlenmeyer 烧瓶,在本生灯的明火上烤至液体开始沸腾.在加热的过程中不断地摇动烧瓶.11、迅速将烧瓶的下半部浸入到一大烧杯（ 2L ）内的沸水中.将烧瓶在沸水中准确放置 40S .延长超螺旋 DNA 于热的时间会使其不可逆变性,所产生的环状卷曲 DNA 不能被酶切割,而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍,难以被溴化乙锭染色.从细菌中用热裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA .但如果将裂解液在 100 ℃精确地放置所推荐时间,可使环状卷曲 DNA 的量减至最小.13、将烧瓶中黏稠的液体转移到超速离心管中（ Beckman SW41 管或与其相当的管）,于 4 ℃用 15000g （或 Beckman SW41Ti 转头, 30000r/min ）离心 30min .起始的细菌培养物长得越密,在此步就越难将该黏稠状裂解物转移到离心管中.如有必要,可用长刃剪刀将裂解物剪成大小易于操作的团块,或过 10ml 注射器使之部分切开.从经氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒 DNA 时,一般不会出现这一问题.
16、测量上清的体积,将其连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀,室温下放置 10min .17、在室温下以 12000g(Sorvall GSA 转头, 10000r/min) 离心 15min ,回收沉淀下来的核酸.若在 4 ℃下离心也会使盐也沉淀下来18、小心弃去上清,将离心管敞开盖,倒置于纸巾上以除去的上清.在室温下用 70% 的乙醇刷洗管底及管壁,倒掉乙醇,并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴.将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉.此时沉淀应该仍然是湿的.19、 用 3mlTE （ ph8.0 ）溶解湿润的核酸沉淀.20、可用柱层析法,聚乙二醇沉淀法或 CsCl- 溴化乙锭梯度离心法纯化粗制的质粒DNA.21、用酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构.相关阅读：
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