缓冲液和溶液 ：碱裂解液Ⅰ ；碱裂解液Ⅱ（裂解液Ⅱ应新鲜制备,于常温下使用） ；碱裂解液Ⅲ （用于筛选质粒的1、挑后的单菌落,接种到 2ml 含有适当抗生素的丰富培养基中（ LB 、 YT 或 Terrific 培养液）,于 37 ℃剧烈振摇下培养过夜.2、将 1.5ml 培养物倒入微量离心管,用微量离心机于 4 ℃以最大转速离心 30s ,将剩余的培养物贮存在 4 ℃.除去上清的简便方法是用一次性吸头或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连.轻微抽吸,并使吸头接触液面.当液体从管中吸除是,尽可能使吸头远离细菌沉淀,以尽量避免沉淀杯喜道侧臂烧瓶中去.也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液,并用吸头除去管壁上附着的液滴.的后果是质粒不能被酶切割或不能完全切割.这是因为培养液中的细胞壁成分多种酶的活性.这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE （菌液体积的 0.25 倍）重悬沉淀并离心.为确保细菌沉淀在碱裂解液 I 完全分散,将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡,可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率.原方案要求在这一步用溶菌酶消化细菌细胞壁,如果处理的细菌培养物体积少于 10ml ,这一步骤可以省略.5、加 200ul 新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速离心管 5 次,以混合内容物,切勿振荡！将离心管放置于冰上.6、加 150ul 用冰预冷过的碱裂解液Ⅲ,盖紧管口,反复数次,使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解分散均匀,之后将管置于冰上 3-5min .8、（选用）加等体积的酚 : 氯仿,振荡混合有机相和水相,然后用小离心机于 4 ℃以最大速度离心 2min .将上清转移到另一离心管中.有些研究者认为不必用酚：氯仿抽提.然而,这一步骤的省略可能会导致获得不能被酶切割的 DNA .用氯仿抽提的目的是从水相中除去的酚.酚在水中为荣,但能被氯仿抽提到有机相中.几年前在一些实验室中,通常用闻气味的方法检查 DNA 制品中残留的酚.该方法不宜提倡.
9、用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸,振荡混合,于室温放置 2min .10、用微量离心机与 4 ℃以最大转速离心 5min ,收集沉淀的核酸.最好养成总是用同一种方法在离心机中放置离心管的习惯,例如,按顺序放置,将离心管的塑料柄朝外.沉淀总是在离转头中心最远的离心管内壁聚集.知道 DNA 沉淀在什么地方可以较容易地找到可见的沉淀,也就能有效地溶解看不见的沉淀.在离心管的侧面及顶部都做好标记,这样即使字迹模糊了也能辨识各管.11、按上述步骤 3 所述小心吸取上清液,将离心管倒置在纸巾上,以使所有液体流出排干,用 Kimwipe 或一次性吸头除去管壁上的液滴.12、加 1ml70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管数次,用微量离心机在 4 ℃以最大转速离心 2min ,回收 DNA .13、再次用步骤 3 所述的方法轻微抽吸除去所有的上清.14、除去管壁上的酒滴,将开口的试管应置于室温使酒精挥发,直至试管内没有可见的液体存在.（ 5-10min ）如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀,在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性.将沉淀在室温下干燥 10-15min 对于乙醇挥发来说足够了,并且不含引起 DNA 脱水.15、用 50ul 含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A （胰 RNA 酶）（ 20ug/ml ）的 TE 重新溶解核酸,温和振荡几秒钟,贮存于 -20 ℃.
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