性内切核酸酶(也可称性内切酶)是在细菌对噬菌体的和修饰现象中发现的.细菌细胞内同时存在一对酶,分别为性内切酶(作用)和DNA甲基化酶(修饰作用).它们对DNA底物有相同的识别顺序,但生物功能却相反.由于细胞每存在DNA甲基化酶,它能在性内切酶所识别的若干碱基上甲基化,就避免了性内切酶对细胞自身DNA的切割,而对感染的外来噬菌体DNA,因无甲基化而被切割.所以性内切酶是该细菌细胞的卫士,它与DNA甲基化酶一齐构成了自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制.如果入侵的噬菌体DNA没有完全被性内切酶切割,残留的噬菌体DNA在复制时,由于DNA甲基化酶的存在,同样地也在识别部位进行修饰——甲基化,性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得,以致大量繁殖起来,该受体细胞也因此遭到了!
目前已发现的性内切酶有数百种.EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型性内切酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA的核苷酸顺序的能力,能在这个性核苷酸序列内,切断DNA的双链,形成一定长度和顺序的DNA 片断.EcoRⅠ和Hind Ⅲ 的识别序列的切口是: EcoRⅠ:GAATTC Hind Ⅲ:AAGCTT
G,A等核苷酸表示酶的识别序列,箭头表示酶切口.性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少个酶切片段,因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别.用已知相对质量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出形状相同的未知DNA的相对质量.
本实验以商品pUC19质粒DNA为标准,以自己提取的pUC19为样品,用性内切酶酶切,再经琼脂糖凝胶电泳分离二者酶切片段,以鉴定自制pUC19质粒DNA.
电泳仪、电泳槽,样品槽模板(梳子),有机玻璃内槽,橡皮膏,锥形瓶(100mL或50mL),紫外凝胶成像系统,玻璃纸,一次性塑料手套.
以上一实验自已提取的pUC19质粒DNA和市售的pUC19质粒DNA为材料,用微量加样器按表1-1所示分别将各种试剂加入0.5ml 灭菌的Eppendorf管内,加样后,小心混匀,编号后,置于37?/FONT>C水浴中,酶解2~3h(有时可以过夜),然后向每个小管中分别加入1/10体积的酶反应终止液,混匀以停止酶解反应.各酶解样品可放入冰箱中贮存备用或直接进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 表1-1 DNA酶解加样表
需要注意的是在加样时,要集中,严格操作,反复核对,做到准确无误.加样时不仅要防止错加或漏加的现象,而且还要保持公用试剂的.应该指出,该项操作环节是整个实验成败的关键之一.
(1)琼脂糖凝胶的制备:琼脂糖凝胶的浓度为1%.方法:称取0.3g琼脂糖,置于50ml锥形瓶中,加入30ml0.5×TBE缓冲液,瓶口用封口膜封好后,置于高压灭菌锅内加热,锅内压力为至121kPa时维持5min,琼脂糖即可全部融化在缓冲液中,取出摇匀,则为1.0%琼脂糖凝胶液.
取橡皮膏(宽约1cm),将有机玻璃内槽的两端边缘封好(注意,将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上,不要留空隙)形成一个边脚模子.
将冷却至65篊左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速度,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层(图1-2).注意:检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡.室温下静置,待凝胶完全凝固(变白色)后,应小心取下橡皮膏,轻轻拔出样品槽模板,在胶板上即形成相互隔开的样品槽.将凝胶放入电泳槽中,放置方向为样品孔朝向电泳槽的负极.
每次加完一个样品,及时更换枪头,以防止相互污染.加样时,应防止碰坏样品槽周围的凝胶面,每个样品槽的加样量不宜过多,本实验室样品槽容量约10~15礚左右.
在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系.但是,在电场强度增加时,不同相对质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的.因此,随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小.为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm.
电泳温度视需要而定,对大的分离,以低温较好,也可在室温下进行.在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时,由于胶太稀,最好在4篊进行电泳以增加凝胶硬度.
加完样品后的凝胶板立即通电,进行电泳.但要注意控制一定的条件,样品进胶前,应使电流控制在10mA,样品进胶后电流为20mA左右.当橙G或溴酚兰染料移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停止电泳.
将电泳后的凝胶浸入菲啶溴红(又叫溴化乙啶,EB)染色液中,进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带. 2、观察和拍照
在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶.DNA存在处显示出红色的荧光条带.紫外光激发30s左右,可观察到清晰的条带.在紫外灯下观察时,应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩,避免眼睛遭受强紫外光损伤.
拍照电泳图谱时,采用透射紫外光,机镜头加近摄接圈和红色滤光片(580~600nm),距离50~60cm.采用全色胶卷,5.6,10~20s.放大为(0.9×1.5)cm2左右的照片,用于相对质量的测定.
(1)DNA的大小:DNA通过琼脂糖凝胶的速度(电泳迁移率)与其相对质量的常用对数成反比.
(2)琼脂糖的浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中,电泳迁移率不相同.DNA的电泳迁移率(M)对数和凝胶浓度(T)之间的线性关系可按下述方程式表示
式中,M.是电泳迁移率,Kr是滞留系数,这是与凝胶性质、迁移大小和形状有关的.因此,要有效地分离不同大小的DNA片段,选用适当的琼脂糖凝胶浓度常重要的,参看表1-2.
(3)琼脂糖浓度与电压关系:通过对琼脂糖凝胶电泳分离大DNA条件的研究,发现以低浓度、低电压分离效果较好.胶的浓度越低,适用于分离的DNA越大,这是一个总的规律.不过浓度太低,制胶有困难,电泳结束后将胶取出来也有困难.在低电压情况下,线性DNA的电泳迁移率与所用电压成正比.但是如果电压增高,电泳分辨力反而下降.因为电压升高了,样品流动速度增快,大在高速流动时,伸展开了,摩擦力也增加,相对质量与移动速度就不一定呈线、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
根据Aaij和Borst用琼脂糖凝胶电泳研究的结果,发现在相对质量相当的情况,DNA的电泳速度次序如下:共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA(本实验结果也应如此),参看图1-4.但琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般位球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同样大小的直线双链DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前进(Rm>0).由此可见,构型不同,在凝胶中的电泳速度差别较大.用琼脂糖凝胶电泳相差一个超螺旋的DNA也可以分开.除DNA外,RNA同样也如此.
(2)标准质粒pUC19与自己提取的pUC19经过酶解(EcoRⅠ或HindⅢ,也可以用其他单一切口的酶)只观察到一条带,因为它具有多个性内切酶的单一切点.如果不是一条带,可能由于酶量加得不足,使pUC19不能完全被酶解成线性,而掺有其他形状所造成.
EB能插入DNA中碱基对之间,导致EB与DNA结合(超螺旋DNA与EB结合能力小于双链闭环,而双链闭环DNA与EB结合能力小于线状双链DNA),DNA所吸收的260nm的紫外光(UV)传递给EB,或者结合的EB本身在300nm和360nm吸收的射线均在可见光谱的红橙区,以590nm波长发射出来.
但应该特别注意的是,菲啶溴红染色液时,应戴乳胶(或一次性塑料)手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污菲啶溴红的器皿或物品,必须经专门处理后,才能进行清洗或弃去.
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