质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,它在基因操作中具有重要作用.质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术.
质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化.本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程.
实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性中,细菌的线性大量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态.将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态.通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA.
2、用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有Amp抗生素的LB培养基中,37℃摇床~250 r/min过夜培养;
3、吸取1.5 ml菌液,12000 g离心2分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净;
4、加入300 ml溶液 I振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意：应彻底打匀沉淀或碎块);
8、吸取800 ml上清液(注意：不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值,若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间,说明质粒质量较好,1.8为最佳,低于1.8说明有蛋白质污染,大于1.8说明有RNA污染.
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