分离质粒DNA的三种方法通常都存在一定量的RNA和大肠杆菌染色体DNA的污染.粗提的质粒DNA可以通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并且可以作为性内切核酸酶和DNA聚合酶的模板和底物.然而,当对智力的纯度有所要求是,如转让哺乳动物细胞所需的质粒,其污染必须被去除或至少降到可接受的水平.
近20年来,在学术文献中报道新的纯化方法的文章几乎每周发布一篇,尽管这些方法的优点已被他们的发明者所,但极少有方法被广泛接受.实际上,许多新方法只是在旧方法的基础上做了少许改进或修改.一般来说,这些初始的旧方法已相当令人呢满意,并且仍有广泛的用途.
无论新旧,所有这些方法都适用纯化小的共价闭环结构的质粒DNA.而将共价闭环结构的质粒DNA与污染的细菌DNA片段分开的最经典的方法是CsCl-溴化乙锭梯度密度离心.目前这一方法依然被认为判断其他方法的标准.这种分离方法取决于能与线状质粒DNA和闭环质粒DNA结合的溴化乙锭的量.在浓缩的盐溶液中溴化乙锭可以和DNA密切结合.溴化乙锭插入碱基之间使双螺旋结构揭开并使之延伸成两条线状的长链DNA或松弛的环状DNA.闭环DNA没有游离的末端,欲使之解开只能靠旋转.随着溴化乙锭越来越多的插入DNA,超螺旋结构的密度逐渐变大以至于溴化乙锭的继续结合.而溴化乙锭与线状DNA的结合则不会被,它继续与之结合直至饱和(通常每2.5个碱基结合一个溴化乙锭).与溴化乙锭结合使线状和闭环DNA的浮密度都降低.然而,由于线状DNA结合的溴化乙锭更多,他们在CsCl-溴化乙锭梯度液中比闭环DNA有更低的浮密度(线),因此在含饱和溴化乙锭的CsCl梯度液中闭环DNA比线状DNA处于更低的.
多年来,CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法.然而,该过程既费时(需3-5天)又需要昂贵的试剂和设备.现在,梯度平衡离心法主要用于纯化以下质粒：1.纯化容易带上切口的特大质粒;2.用于转染哺乳动物细胞的闭环质粒;3.用于生物物理学测定的治理.对于那些在酶切反应和克隆常规操作中用作第五盒模板的小质粒(小于1.5kb),则用更加低廉和快速的方法来纯化.这些纯化方法主要依赖于不同的沉淀反应,像离子交换色谱法或者从细胞核酸中分离质粒DNA的凝胶过滤层析法.
很多有效的质粒纯化试剂盒已经商品化.这些试剂盒包括用来吸洗脱质粒DNA的一次性色谱柱.有许多不同的基质,包括玻璃、硅藻土等,但最常用的是阴离子树脂如DEAE(二乙氨乙基)或QAE[二乙(2-羟丙基)氨乙基].当然,同时具备必要的缓冲液、树脂和一次性竹子则更为方便.然而,由于试剂盒较为昂贵,应考虑是否有必要用昂贵的试剂盒替代任何一个实验工作者都可以轻易配制的试剂.用于常规实验的少量制备质粒DNA当然不用使用试剂盒.在文献中所提到的上百种纯化质粒DNA的方法中,碱裂解法因其简便、低廉和有效最受欢迎.碱裂解法已经在成百个实验室的小量实验中成功应用了20余年.对于大量制备,首选方法是经碱裂解后用聚乙二醇分级沉淀DNA,所得到的质粒DNA其纯度足以用于转染哺乳动物细胞、酶切反应和DNA测序.在某些需要超纯质粒DNA的情况下(如显微注射哺乳动物细胞),可以选用CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心法或适当的试剂盒.如果选用试剂盒,应在实验前详细阅读厂商的介绍和操作规程.
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