DNA提取与纯化：质粒抽提的8大窍门

　　过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况.如果出现了问题,调整培养时间会有帮助:Nick 多,则增加培养时间；酶切出现问题,则减少培养时间.大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”,但一定要养成每次都观察菌体量的习惯,因为质粒毕竟是在菌体中,而且,抽提质粒所用的试剂量,都只与菌体量有关.如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在溶液 II 加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块.这个团块在溶液 III 加入后,会有一部分这是适合所有核酸抽提的.试剂相对过量的好处是:稳定性好,纯度高,操作更简单.如果认为这样不经济,就少用一点菌体.加入溶液II 后,混匀,体系最好能立即变得清澈.体系如果变得清澈了,马上加入溶液 III 中和.如果体系不马上变清澈,下次少用一点菌液,或者多用一点溶液.如今的质粒设计得越来越复杂了,奇怪的现象也越来越多,而所有的奇怪现象,多与裂解时间有关.中加入溶液III 后,先两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次,再混匀.效果非常好.一定要将蛋白质彻底离心下去.如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面,继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中,再离心,效果要好许多.(100ug/ml),或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒,都可以降低 RNA 残留,但都不能彻底去除.幸运的是,RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途.如果想彻底去除 RNA 残留,可以用试剂盒,或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase.gDNA的残留问题,必须在抽提过程中解决,否则,就只能用胶回收方法处理了.gDNA 越大,越难于复性,也就越容易被去除；所以,一定要尽可能不打断 gDNA.裂解体系越粘稠,gDNA 越容易被扯断；操作手法越重,gDNA 也越容易被打断.温和操作,使用相对过剩的试剂,是降低 gDNA 残留的最好方法.蛋白质的去除,主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成.虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间,可以形成更多的该不溶复合物,从而使蛋白质残留更少,但实践证明这样做并不是必须的,除非是大量抽提.只要加入溶液 I 后的悬浮,加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的,蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够,甚至过剩,才能确保裂解和中和是彻底的.当然,试剂盒及苯酚的使用,是可以更进一步降低蛋白质的残留的.收获时间,菌株的选择,抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素.细菌收获过早,质粒还在复制过程中,Nick 的比例较高；过晚,细菌开始死亡,杂质会比较多.如果使用胞内酶含量很高的宿主菌,会出现较高比例的 Nick.加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作,也可以导致一些 Nick,但影响不会比前两者大.理论上,用碱裂解法抽提质粒,变性超螺旋的出现是不可避免的.之所以大家没有非常在意,一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响,二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到.抽提使用相对过剩的溶液,在加入溶液 II 后,体系能在 1 分钟内变,再快速加入溶液 III,这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平. (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点.)提供了一个没有进一步解释的观察:从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19),电泳能发现很多条带；但使用单酶切后,仍然变成一条带,大小正好是线性单质粒的大小.根据这一观察,可以推理如下:那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的,而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二,这种“粘”只是部分的,否则酶切会有问题；第三,这种“粘”是脆弱的,线性后的刚性足以打破它.如果是这样,质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关,可以不管它(也管不了),因为它不影响酶切,或者说,即使质粒多聚体切不动,也不会影响太大.总之,碰到这种情况,不要简单地认为有问题,而是应该一步一步往下做,但一定要做完一步,检测一次,看一看结果与预期的吻合程度.