许多年来,一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效,然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中,采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好.
1)将 30ml 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6).培养基中应含有相应抗生素,用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种.
2)将含相应抗生素的500ml LB rrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物,于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分),所得培养物的OD 600值约为0.4. 3)可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇),使终浓度为170μg/ml.像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒,有必要通过扩增.这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数,因此无需扩增.这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯.但用氯霉素进行处理,具有细菌复制的优点,可减少细菌裂解物的体积和粘稠度,极大地简化质粒纯化的过程.所以一般说来,尽管要在 生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还是利大于弊.
1)用合适转头于4℃以4000 转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽.
1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml(18ml)溶液I中.
封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相.置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀.于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物.
5 )用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转.如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000 转/分再度离心20分钟, 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体.未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)] .
8 )小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁.倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后的痕量乙醇挥殆尽.
最新评论