DNA提取与纯化：质粒抽提的部分问题

　　消化后,RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响.如果要彻底去除残留得 RNA,则需要更烦琐的操作.基本上是采用两种办法:一是利用酶/弱去污剂部解细菌,在抽提时只让质粒从细菌中出来,而不让基因组 DNA 从细菌中出来,从而将质粒和基因组DNA分开;二是利用NaOH/SDS完全裂解细菌,让质粒和细菌基因组DNA都从细菌中出来,再利用质粒和基因组DNA在变性/复性过程中的不同表现,将基本上是与去除细菌基因组同时实现的.但是,依据不同的细菌,不同的培养条件,以及操作时的精细程度等,杂质的残留量会不同.所以,通常需要使用苯酚做更进一步的纯化.经过的处理,沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了.如果要用于更高级的实验,如转染,则需要做进一步的纯化,如CsCl裂解法.详细情况见“克隆”.试剂盒几乎都使用碱裂解法,所以都有一个通病,抽提大质粒时效果不好.质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特点.关于碱裂解法的原理,复旦大学生化与生物学实验室的网站有一篇专论,大家可以去看一下.这是一篇美文,非常有趣.文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点,也常有的.当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性;不适合大质粒的抽提.碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就成为不可逆的了(电泳时在超螺旋前面一点点,如果有一条带,就是此变性的质粒.).所以,要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间. (似乎可以做这么一个推理:在碱性条件下,质粒的两条链从一点或者几个点开始分开,随着时间的延长,直到完全分开.理论上讲,完全分开的两条链要很快地配对复性,成功率肯定不可能是100%的,而没有完全分开的两条链却完全可能100%配对复性.) 碱裂解法不适合大质粒的抽提,原因也是因为该方法太剧烈,使超螺旋比例较低.文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法,缺点是得率要低一些.现在得问题是,大质粒的拷贝数本来就低,如果抽提方法得率再不高的话,抽提起来就很费力了.如果注意到在碱裂解法中,超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低,随着粘稠度的增加而减低这个现象,完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的:增加试剂的使用量,使加入 NaOH/SDS 液后,溶液在 1 分钟内就能变得很清澈;立即加入中和试剂.这个实验我们没有做过,但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法.