DNA提取与纯化：动物细胞基因组DNA的制备

　　、脂类和糖类等分离，又要保持DNA的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在提取DNA的反应体系中，SDS可、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则细胞中DNase的活性；蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或从核酸样品中去除蛋白质常用等体积平衡酚和氯仿：异戊醇（24：1）组成的混合物。其中氯仿可使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离，异戊醇有助于减少抽提过程中泡沫的形成。平衡酚的pH应在7.8以上，否则DNA会进入有机相。2. STE溶液：0.15 M NaCl，10 mM Tris-HCl （pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。高压灭菌。3. 20% SDS：900ml水溶解200g电泳级SDS。加热到68°C并用磁力搅拌器搅拌助溶。如果需要，加几滴浓HCl调解pH为7.2。用水定容到1000ml。室温保存，无须灭菌。7. “酚/氯仿/异戊醇”溶液：25ml平衡酚, 24ml氯仿、1ml异戊醇混合。混合物上覆盖一层100mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，在不透光的瓶子中4℃保存1月。9. 10M 乙酸铵（NH4Ac）：70ml水溶解77g乙酸铵，用水定容到100ml。用0.22μm滤器过滤除菌。密闭瓶中室温保存。11. ACD抗凝剂（用于新鲜血样抽取或冻存血样）：0.48% （m/V）柠檬酸，1.32% （m/V）柠檬酸钠，1.47%（m/V）葡萄糖。沉积。沉积的血细胞可立即用于DNA制备，或50μl分装，-20℃短期保存或-80℃长期保存。3. 取50μl TE细胞悬液或50μl沉积的鱼血细胞，加入450 μl STE溶液，10μl 20% SDS（终浓度0.5％）和10 μl 20mg/mL蛋白酶K（终浓度400 μg/mL），轻轻混匀，55℃水浴消化3h或过夜。4. 将溶液冷却到室温，加入等体积平衡酚，缓慢混合10min，12000rpm 离心15min。6. 水相中加入等体积平衡酚，缓慢来回试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。7. 水相中加入等体积“酚/氯仿/异戊醇”溶液，缓慢来回试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。9. 水相中加入等体积氯仿溶液，缓慢来回试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。10. 转移水相转移到新离心管中，加入0.2体积的10M 乙酸铵和2倍体积室温无水乙醇（若使用冰冷乙醇，会让一些残留的RNA也沉淀出来。），水平旋转或轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA会形成丝状析出物。12. DNA沉淀中加入500μl 70%乙醇，试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。15. 依据DNA团块的大小，加入50~200μl TE缓冲液，溶解DNA（45~55℃保温有助于DNA溶解。DNA样品也可以4℃过夜溶解。）。2. DNA溶液短期使用可在4℃存放，长期储存应分装后保存在-20℃或-80℃，但要避免反复冻融。