用牙签从琼脂培养基上挑取的菌落可直接用于质粒 DNA. 所得的闭合环状 DNA 往往太多,不能作为大多数酶的底物.但是,牙签法也有很多用途,例如,它可用来鉴定后重组质粒的克隆,用来估计转座子中质粒的大小,用来比较在相同宿主中不同质粒拷贝数的多少.待测重组子中插入的片段的性质可用 Southern 杂交及聚合酶链反应( PCR )加以确定.
以下介绍的简易操作方法是有 Barns 修订的方法,它对于大菌落(直径 2-3mm )很有效,而且所获 DNA 的量足够琼脂糖电泳时一个泳道的上样量.
琼脂糖凝胶( 0.7% , 5mm 厚),用不含溴化乙锭的 Tris- 乙酸盐或 Tris- 乙酸盐缓冲液 配制及电泳 ;琼脂糖凝胶
1、在含适当抗生素的富养琼脂培养基( LB 、 YT 或 SOB )上培养了适当质粒的菌落,知道它们的直径长至 2-3mm (对于大多数菌株,需要 37 ℃下培养约 18-24h ).
2、用无菌牙签或一次性小环将细菌菌落的一小块转移到含适当抗生素的一条或一小块琼脂母板上,将该菌落的剩余部分转移到已编号的微量离心管中,管内含有 50ul 无菌的 10mmol/L EDTA(PH 8.0) .除待试菌落外,还应转移几个“空”菌落(不会外源基因的质粒载体).这几个样品可在凝胶电泳中用作质量标准参照物.
4、当所有菌落都被复制和转移之后,将母板在 37 ℃培养几个小时后于 4 ℃保存,直到得到凝胶电泳结果.然后从母板上收获其质粒为预期大小的菌落.
5、在培养目标的时候,对细菌悬液进行以下的处理：在每一微量离心管中顺序加入 20ul 新配制的 NNS 溶液.盖上管盖,振荡混匀 30s .
10、将上清液一次转移到洁净离心管中.如果只用琼脂糖凝胶电泳分析样品,在每管中加入 0.4% 的溴酚蓝溶液;如果既要用琼脂糖电泳又要用 PCR 分析,则在样品中加入 2ul 10mmol/L 甲酚红.在 0.7% 的琼脂糖凝胶( 5mm 厚)的加样孔( 5mm 长, 2.5 , mm 宽)中加 50ul 上清
琼脂糖凝胶不含溴化乙锭,且所用的缓冲液也不含溴化乙锭,因为这样超螺旋 DNA 的迁移率比插入染料后更准确地反映其质量.这就能更容易地区分不同大小的质粒.
11、当溴酚蓝迁移到胶的 2/3 或 3/4 处,或甲酚红迁移到胶的一半时,室温下将胶浸在溴化乙锭( 0.5ug/ml 的水溶液)中染色 30-45min .在紫外灯下观察凝胶并拍照.
12、如果在第 10 步中使用甲酚红,则宜用第 8 章方案 1 中描述的 PCR 方法分析上清(用各样品的剩余液作为模板)
甲酚红在酸性溶液中是橙色到琥珀色的, ph 为 7.2 时时的,在碱性溶液中是红色的.与溴酚蓝和二甲苯蓝不同,甲酚红不印制 DNA 聚合酶的热稳定性.因而,含甲酚红的 DNA 溶液在大多数扩增反应中可用作模板.此染料在 2% 的琼脂糖凝胶中的迁移位于在二甲苯蓝和溴酚蓝之间,大小大约相当于 300bp .在琼脂糖凝胶电泳照片中,甲酚红不会产生像溴化乙锭染色一样的阴影.
13、将母板上可能含有重组子的菌落接种到含适当抗生素的 2ml 液体培养基( LB 、 YT 或 SOB )中,进行小规模培养.
14、在此小规模培养物小量制备待测的重组子质粒.用酶切及琼脂糖电泳分析质粒 DNA ,以确证其大小和结构与预期一致.
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