3、用多通道移液器在微培养板的每个孔中加入50ul细胞裂解液.将数张湿的吸水纸置入一个聚丙烯盒中(如Tupperware盒),再将盛有细胞裂解液和西部微培养板放在吸水纸上,用盖封严盒子.
5、将叶子移出温箱,取出培养板平放在工作台上,冷却数分钟,每孔加入100ul NaCl/乙醇溶液.不用混匀,直接将培养板于室温温育30min.温育末期硬件到纤维状的核酸沉淀.
6、缓慢地倒转培养板,将乙醇溶液倒入水池.核酸沉淀应黏附在培养孔的底部,将每个培养板倒置于干燥的吸水纸上,使乙醇从培养板流出.
7、每孔加入150ul 70%乙醇,小心不要移动核酸沉淀.按步骤6倒转培养板以去除70%乙醇.在吸水纸吸取多余的液体.用70%乙醇再冲洗沉淀2次.
8、使培养板在室温干燥直至最后的乙醇挥发.如果基因组DNA将用于PCR分析,进行步骤9. 如果DNA将用于Southern杂交,进行步骤10.11和12 .
10、如果DNA将用于Southern杂交,制备下列性内切核酸酶混合物;每孔需40ul.
11、用多通道移液器在每个孔中加入 40ul 性内切核酸酶反应混合物.反复抽吸数次使孔中内容物混合,小心避免气泡.按步骤3用Tupperware容器制作湿盒,将培养板放入,使反应在适宜的消化温度温育12-16h.
12、加入5-10ul蔗糖凝胶上样缓冲液终止反应,按方案8、9、10描述的方法进行Southern印迹和杂交以分析消化的DNA.
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