1. 标本预处理：将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中,加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS),混匀,3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清.重复一次.用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀,37℃水浴温育1h.
2. 消化：上述DNA提取液混悬白细胞,37℃水浴温育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀,液体变粘稠.50℃水浴保温3h,裂解细胞,消化蛋白.保温过程中,应不时上下转动几次,混匀反应液.
3. 酚抽提纯化DNA：上述反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚溶液,温和地上下转动离心管5-10min,直至水相与酚相混匀成乳状液.5000g离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中.重复酚抽提一次.加等体积的氯仿:异戊醇(24﹕1),上下转动混匀,5000g离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中.重复一次.
4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇,室温下慢慢摇动离心管,即有乳白色云絮状DNA出现.用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA,转入另一1.5 ml离心管中,加70%乙醇0.2ml,5000g离心5min洗涤DNA,弃上清,去除残留的盐.重复一次.室温挥发残留的乙醇,但不要让DNA完全干燥.加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动,DNA完全溶解通常需12-24小时.
5. DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释,以TE液作空白对照,在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值.
分别采集外周静脉血5ml,2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶).
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