用含氯化铯和溴化乙锭的悬浮密度梯度离心法分离质粒和染色体 DNA 的方法,取决于线性 DNA 和闭环 DNA 结合的溴化乙锭的量的差异.
许多年来,纯化大量质粒 DNA 的首选方法是 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法.但由于这种方法耗时费钱,于是发展了许多其他方法,包括差异沉淀法和柱层析法.尽管如此,许多传统的人仍然认为,用 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法纯化的质粒 DNA 是最纯最好的.由于用 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法纯化的闭环 DNA 有宿主菌的小片段 DNA 和 RNA 的污染,这些小片段比质粒 DNA 需要更长的是 ianzaiCsCl- 溴化乙锭梯度中达到平衡.因此当闭环 DNA 达到平衡时,小片段仍在不同梯度均与分布.这一问题可以通过一些两种办法来解决：采用商品化的树脂柱层析法取代 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心法,或将 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离到的闭环质粒 DNA 进行第二轮 CsCl- 溴化乙锭梯度密度离心.
另一种方法称为不连续 CsCl 梯度离心法： CsCl 溶液在离心管中按三种不同浓度分层排布,经离心, CsCl 梯度的形成更可,离心时间缩短到 6h .但是,不连续 CsCl 梯度离心法将闭环质粒 DNA 与染色体及开环质粒 DNA 分离的效果不如连续梯度离心法.
在下述连续梯度离心中,将溴化乙锭和粗制质粒 DNA 与密度约为 1.55 的 CsCl 溶液混匀.当混合物以高速离心时,离心力足以产生并维持铯离子的梯度.在梯度形成过程中,不同浮力密度的 DNA 进入与其带有相同密度的 CsCl 层.欲达平衡梯度,以往需要离心 24-28h ;但由于现代的垂直管转头离心力高,直径小,因而其梯度的形成比用旧事的低速固定角度的转头快的多.
CsCl (固体);CsCl 再分带溶液 ;可选, 乙醇 ;溴化乙锭( 10mg/ml ) ;石蜡油 ;核酸和寡核苷酸 ;粗制质粒 ;离心机和转子 ;Sorvall-SS34 或与其相当的转头;超速离心机转头(最好用垂直式)和离心管
1、测定粗制质粒 DNA 的量.最好通过向一个已在天平上调零的洁净管中加入溶液来测定,每克质粒 DNA 溶液中准确加入 1.01g 固体 CsCl ,闭上管盖以防蒸发,于 30 ℃温育促使 CsCl 溶解.轻轻混合溶液直到 CsCl 溶解.
溶液的终密度应约为 1.55g/ml, (折射率为 1.3860 ),溴化乙锭的浓度约为 200ug/ml. 以往曾认为,欲使溴化乙锭与闭环 DNA 和线状 DNA 的结合达饱和,大剂量的溴化乙锭是必需的,所以溴化乙锭的用量要大得多.然而,由于高浓度未结合的溴化乙锭可能会使微弱的 DNA 区带模糊不清以致在紫外线下才能看到.因而近年来成功使用低浓度的溴化乙锭,使得 DNA 区带在可见光下.不过当含有低浓度溴化乙锭的梯度载有过量核算时,又会出现问题：在这种情况下,可能没有足够的溴化乙锭与闭环 DNA 和线状 DNA 达饱和结合.因为在 CsCl- 溴化乙锭梯度中大多数溴化乙锭不是与 DNA 而是与存在于粗制质粒 DNA 的细菌 RNA 结合,所以在超速离心之前用不含 DNA 酶的 RNA 酶处理粗制品,此问题可予解决.如果来自 50ml 细菌培养物的粗提质粒 DNA 用 3ml TE ( ph8.0 )重溶,再用来制备一个 5ml 的 CsCl- 溴化乙锭梯度,则该处理通常不是必需的.
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