质粒提取:质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

  .带有遗传信息,可赋予细菌某些新的表型.将质粒指纹图谱分析方法、质粒 DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤:即细菌的培养和质粒DNA的扩增;细菌菌体的裂解;质粒DNA的提取与纯化.

  细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后,菌体裂解,可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内出来,经琼脂糖凝胶电泳,因各种核酸的迁移率不同将上述核酸分成不同的带.用溴化乙锭(EB)染色后,在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光.根据荧光的,可区分不同的核酸带.【材料】

  1、接种细菌于5mlLB液体培养基中,37℃培养过夜.2、3000rpm/min,离心15min,弃上清.加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀.3、加入200ul前新配制的溶液II,EP管5次混合均匀,置冰浴2min.4、加入150ul溶液III温和地混匀,12000rpm/min,离心5min.5、吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次,12000rpm/min,离心2min.(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍体积的冷乙醇,12000rpm/min,离心10min.6、弃乙醇,干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸,待电泳检测.二、琼脂糖凝胶电泳

  琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法.凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径.琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段.琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用.它首先利用琼脂糖的筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA带负电荷,从负极向正极移动.根据DNA大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离.借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的.【材料】

  1、取琼脂糖0.9g,加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,100℃加热溶解.2、平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5~1mm).3、铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至500C左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5~8mm.4、待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负极端,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2~3mm,小心拔出梳子.5、DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出).6、打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm.7、据染料移动的,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间).8、电泳完毕关闭电源.将凝胶放紫外灯下观察并拍照.

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