,所获得的 DNA 产物可用于电泳分析或性内切核酸酶消化,经柱层析进一步纯化之后,还能用于转染碱裂解液Ⅰ ：若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒 DNA ,无菌的碱裂解液 I 在使用前可补充适当体积的去的 RNA 酶 A （胰 RNA 酶）（ 20mg/ml ） , 使之终浓度为 100ug/ml ,若欲用其他的方法纯化 DNA ,则不推荐在此步骤添加 RNA 酶.
细胞的制备1、挑后的单菌落,接种到 10ml 含有适当抗生素的丰富培养基中（ LB 、 YT 或 Terrific 培养液）,于 37 ℃剧烈振摇下培养过夜.为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养液的体积大 4 倍.试管不宜盖紧培养物应在剧烈振摇下培养.2、将培养物转移到一个 15ml 的试管中,与 4 ℃以 2000g （用 Sorvall SS-34 转头, 4000r/min ）离心 10min 后收集细菌.3、用轻缓抽吸的方法,尽可能吸干培养液.除去上清的简便方法是用一次性吸头或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连.轻微抽吸,并使吸头接触液面.当液体从管中吸除是,尽可能使吸头远离细菌沉淀,以尽量避免沉淀杯喜道侧臂烧瓶中去.也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液,并用吸头除去管壁上附着的液滴.未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被酶切割或不能完全切割.这是因为培养液中的细胞壁成分多种酶的活性.这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE （菌液体积的 0.25 倍）重悬沉淀并离心.细胞的裂解
4、将细菌沉淀重悬于 200ul 用冰预冷的溶液 I 中,剧烈振荡,将悬浮液转移到微量离心管中.为确保细菌沉淀在碱裂解液 I 中完全分散,将两个微量离心管的管底互相接触同时振荡,以提高细菌沉淀分散的速度和效率.原方案要求在这一步用溶菌酶消化细菌细胞壁,如果处理的细菌培养物体积少于 10ml ,这一步骤可以省略.5、加 400ul 新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速离心管 5 次,以混合内容物,切勿振荡！将离心管放置于冰上.应确保离心管的整个内壁均与碱裂解液Ⅱ接触.6、加 300ul 用冰预冷过的碱裂解液Ⅲ,盖紧管口,反复数次,使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解分散均匀,之后将管置于冰上 3-5min .7、用微量离心机于 4 ℃以最大转速离心 5min ,转移 600ul 上清到一只洁净的离心管中.8、加等体积的酚 : 氯仿,通过剧烈振荡混合有机相和水相,然后用微量离心机于 4 ℃以最大速度离心 2min .将上层水相转移到另一离心管中.质粒 DNA 的回收9、在室温下加 600ul 异丙醇以从上清中沉淀核酸,剧烈振荡混合溶液,于室温下放置 2min .10、用微量离心机与 4 ℃以最大转速离心 5min ,收集核酸沉淀.11、 按上述步骤 3 所述小心吸取上清液,将离心管倒置在纸巾上,以使所有液体流干,再将吸附于管壁的液滴除尽.12、加 1ml70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管数次,用微量离心机在 4 ℃以最大转速离心 2min ,回收 DNA .13、再次用步骤 3 所述的方法轻微抽吸除去所有的上清.这一步骤要格外小心,因为沉淀又是贴壁不牢.14、 除去管壁上的酒滴,将开口的试管应置于室温使酒精挥发并在试管内没有可见的液体存在.（ 5-10min ）如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀,在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性.将沉淀在室温下干燥 10-15min 对于乙醇挥发来说足够了,并且不含引起 DNA 脱水.15、用 100ul 含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A （胰 RNA 酶）（ 20ug/ml ）的 TE 重新溶解核酸,温和振荡几秒钟,贮存于 -20 ℃.
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