从理论上讲,用质粒载体进行克隆是十分简单的.闭环质粒被一种或几种性内切核酸酶切割后与具有相匹配的末端的外源 DNA 在体外连接,连接反应的产物即可用于合适的 E . coli 菌株.然后通过 PCR 、杂交或性内切核酸酶消化筛选具有目的 DNA 序列的克隆.
这些听起来很容易,然而要确保克隆实验的顺利成功,必须深思熟虑!在拿起移液器之前,必须做出如下考虑：
在以下材料准备就绪后,下一步要制定一个周密的计划,以使片段、质粒、感受态细胞核探针等制备工作能够在程序和时间上有条不紊的进行.多数情况下,用质粒载体产生一个特定的重组子有几种不同的途径.但准备一个不就措施仍很重要,以防万一在执行原计划过程中出现难以预料的困难.
最容易克隆的是具有 5’ 或 3’ 凸出末端的 DNA 片段.识别序列内部不对称的性内切核酸酶消化载体和目的 DNA 很容易产生这些长 1-6bp 的单链末端.当 DNA 片段和载体的凸出末端相互匹配时,二者就能复性形成一个线状杂交,他们通过凸出末端的碱基间的互补配对连接在一起.因此,经如下的两部反应形成可以大肠杆菌的环状重组质粒.
复性使载体和目的 DNA 片段以两种方向插入.故单环重组质粒只互补凸出末端 DNA 间连接反应众多潜在产物中的一种.其他非重组产物包括各种大小、方向和组成的线性和环状的同源或异源多聚体.为了提高环状单倍重组子的比例,连接反应必须仔细设计,这并非轻而易举.第一步间的发那英需要高浓度的 DNA ;而第二步内反应在 DNA 浓度低时效率更高.一般地,在 DNA 的总浓度小于 10ug/ul 的情况下,以等摩尔量的质粒和目的 DNA 间的连接反应通常能够得到可接受的单倍环状重组子产量.当质粒载体与目的 DNA 的摩尔比不正确时,连接反应会导致出血令人不快的高比率的空质粒(没有任何插入片段)或外源 DNA 片段的插入.在每个重组克隆中,插入 DNA 片段的数目必须通过性内切核酸酶图片或其他方法验证,外源 DNA 的插入方向也必须确定.
以上我们讨论了具有相同 DNA 末端的连接反应,也就是把质粒和外源 DNA 以相同的单一性内切核酸酶处理后所进行的连接反应.一种增加环状单倍重组质粒的方法是：应用不同末端的连接反应策略,就是把外源 DNA 片段用不同识别位点的两种酶消化.在这种情况下,外源 DNA 的两个末端并不互补,彼此不能相互连接.因此,外源 DNA 就会如愿地与用两种相同酶处理过的质粒载体相互连接,形成高比例且含预定方向的单倍环状重组质粒.这一过程称为强制连接或定向克隆.
具有平末端的外源 DNA 片段可以克隆岛带有平末端的线状质粒载体中.平末端的连接反应时一种相对低效的反应.以下是克隆平末端 DNA 片段的合适反应条件
最后一个条件是成功的关键.在高浓度下,平末端 DNA 形成丰富而短暂的连接,使 5’- 磷酸基和 3’- 羟基紧密接触. DNA 连接酶捕捉到这种短暂的亚状态,并在不同集团间形成永久的磷酸二酯键.线状共价杂交的产物可以通过平末端间的内连接反应形成可以用于大肠杆菌的环状重组质粒.在理论中,第一步反应要求高浓度的 DNA ,而第二步反应在 DNA 浓度较低时更有效.一些研究者因此提出第一步反应在高浓度 DNA 下进行,经温育 1h 后,反应体系用连接缓冲液稀释 20 倍,再加入新的连接酶后继续温育 4h .
在 DNA 量不足是,可通过反应体系中加入促进大聚合的物质 [ 如 5% 聚乙二醇 800 ( PEG8000 ) ] 或导致 DNA 凝聚的物质(如 1.0mmol/L 氯化六氨合高钴)来获得足够浓度的平末端.这种聚合和凝聚试剂可使平末端 DNA 的连接效率提高 1-3 个数量级,并促进间的连接反应,印制内连接反应.
质粒载体的克隆基于少许几种常见的基本方法,均简单有效.方案 17 和 19 介绍了包括凸出末端和平末端的 DNA 片段和质粒连接的基本技术.方案 18 、 20 、 21 和 22 介绍了获得适合重组质粒的各种优化策略.这些简单技巧的组合使质粒重组这一技术变得复杂而美妙.
最新评论