大多数研究者都想使用容易质粒DNA的大肠杆菌菌株(如DH1或MM294).大多数colE1型的质粒导入这些菌株后都可进行高拷贝数的时效率较低、产生的菌落也比通常要小,质粒DNA的产量也低.多数这种“困难”质粒能编码对大肠杆菌存在毒性的蛋白质,或者他们含有反转的或重复的DNA序列.
解决毒性蛋白问题的办法包括使用可扩增的低拷贝数载体,或者使用含有能外源DNA序列的原核终止信号的高拷贝数载体.另一种可能的方法是使用可降解colE1型质粒拷贝数的大肠杆菌菌株.有几个商品化的大肠杆菌菌株(如Stratagene公司ABLE C和ABLE K)可是colE1质粒的拷贝数降低4-10倍,因此由质粒编码的毒性蛋白的水平也得到同样程度的降低.尽管质粒DNA在这些菌株中的产量降低,但仍足以满足克隆中的大多数要求.
如果怀疑某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列,那么就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性.例如,携带recA基因突变的菌株就几乎没有充足的可能性,这些菌株是用于小鼠基因敲除实验的靶向载体(如含有双拷贝病毒胸苷激酶基因的载体)的首选宿主.在携带recB基因突变的菌株中,反常插入也可能是稳定的,它使外切酶Ⅴ失活,并将重组降低到正常的百分之几.最后,已有报道已经在SOS修复或DNA修复缺陷的菌株(带有umuC和uvrC基因突变)中某些质粒产量得到提高.
反向重复序列对他们携带的质粒通常是的.因此,含有300bp以上完美的或近乎完美的反向重复序列的重组质粒不能传统的大肠杆菌宿主,或者效率很低.在多数情况下,这些克隆的增殖可引起内部缺失或其他重排,从而改变回文序列的对称性.含有头头相对的回文序列是的,这也许是因为他们通过干扰复制叉的移动而印制DNA的复制,或者是因为他们质粒的超螺旋状态,使其容易受到核酸酶的.
没有一种大肠杆菌菌株能所有含回文序列的重组克隆的增值.携带recBC和sbcBC基因突变的大肠杆菌菌株可支持各种不同大小和来源的回文序列的质粒的生长.然而,带有colE1起点的质粒recBC和sbcBC宿主菌中是不稳定的,因为他们可形成线状多聚体,后者明显地干扰染色体DNA的复制和分配.多聚体的形成依赖于参与RecF重组通的一套蛋白质,因此它在RecF、RecJ、RecA、RecO或RecQ功能缺陷的细胞中不能产生.
最后,如果用质粒载体来增殖甲基化DNA(如哺乳类基因组DNA或者在体外用三磷酸脱氧核苷酸的甲基化类似物合成的DNA),必须采用McrA、McrBC、Mrr/Mcf系统缺陷的菌株.McrA和McrBC系统识别和含甲基化胞嘧啶残基的某些DNA序列,而Mrr/Mcf系统既识别含甲基化腺嘧啶残基的某些DNA序列.
最新评论