DNA提取与纯化：oligos纯化方法的比较

　　,将采取方法有脱盐、BioRP、PAGE、HPLC等进行oligos纯化的工作.各种方法的侧重点不同,需根据具体实验的要求来选择最适合的纯化方法：结构,首先必须去除基团.通过浓氨水处理,合成的寡核苷酸从固相载体上分离,2-氰乙氧基――磷酸二脂键的基团,以及碱基的基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除,从而形成了天然的DNA结构.然而,必要的去步骤完成后,寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小有机化合物.所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐.脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行.尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质,但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链.然而,脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究.如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成,则N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基团,提前终止的寡核苷酸不包含该基团.因为DMT基有强的亲脂的特性,有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性,因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化.利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力,但是提前 终止的寡核苷酸不包含DMT基团,所以,我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来.对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer）,我们推荐PAGE纯化法,它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶(电泳)作为纯化.尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%）,但它在额外的步骤方面有一些缺陷,比如在PAGE之后需要提取和脱盐,继而将导致纯化产率的下降.如果合成的寡核苷酸应用于克隆,定向诱变或定量的基因探测,那么对其纯度要求较高.脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求,则HPLC纯化被广泛地用于这个目的.作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化.阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的.反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率.因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度,用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35-mer).