仅仅靠就能判断一个子是携带了重组质粒还是空载体是极为罕见的.在一些例外的情况下,携带重组质粒的克隆可能会比正常的小一些,这是因为表达外源蛋白的治理延缓宿主细胞的生长.例如,当编码调控蛋白或膜蛋白的外源 DNA 序列被克隆岛质粒表达载体中时就可能发生这种情况.但是,在克隆的常用质粒载体中,外源蛋白的表达水平并不太高.
近年来,建立了许多方法以区别带有重组质粒的克隆和空质粒的细菌.其中最经得起的通用的方法使用性的组织化检测细菌的β -gal 活性.这种方法通常被用来确定所获得的克隆是否携带重组质粒.另外对那些用特殊外源 DNA 序列的重组质粒,其克隆的坚定可用原位杂交方法.筛选克隆的其他常用方法还有分析重组质粒和大小的 PCR.
在此我们没有介绍关于只允许重组子生长而印制由非重组质粒的细菌的生长的“阳性选择系统”.实际上这类方法很少使用,即使毕生致力于 DNA 重组的人也可能从不需要他们.对此方法的机制感兴趣的研究者可本章导言中介绍及其中相关引文.
现在使用的许多载体质粒(如 pUC 系列, pBluescript 、 pGEM 和它们的衍生载体)都带有一个大肠杆菌 DNA 的短片段,其中含有β - 半乳糖苷酶前 146 个氨基酸的编码信息及调控序列.在这个编码区中插入了一个多克隆位点,他不读框,但可使少数几个氨基酸插入到β - 半乳糖苷酶的 N 端,而不影响功能.这种类型的载体适用于可编码β - 半乳糖苷酶 C 端部分的宿主细胞.尽管宿主和载体编码的片段都没有活性,但他们能够融为一体,形成具有酶活性的蛋白质.这样, lacZ 基因上确实近操作基因区段的突变体与带有完整的近基因区段的β - 半乳糖苷酶的突变体之间实现互补,这种互补现象成为α互补.有α互补而产生的 lac+ 菌落易于识别,因为它们在生色底物 X-gal 存在的情况下形成蓝色菌落.然而外源 DNA 片段插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致产生无α互补能力的 N 端片段.因此,携带重组质粒的细菌形成白色菌落.这一简单的颜色试验大大简化了在这种构建质粒载体中鉴定重组子的工作.仅仅通过目测就轻而易举地筛选数千个菌落,并识别可能含有重组质粒的菌落.然后通过小量制备质粒 DNA ,进行酶酶切分析或其他方法就可以确定这些质粒的结构.用α互补筛选重组子的方法请参见方案 27. α互补法筛选时非常可靠地,但并非永不出错.
外源 DNA 的插入并不总是激活β - 半乳糖苷酶α片段的互补活性.如果外源 DNA 很小(小于 100bp ),或者插入片段没有编码框,也没有影响α片段的结构,就可能不会严重影响α互补.虽然这种现象在文献中有所报道,但是极为罕见,因此只对遇到这种问题的研究者才有意义.
不是所有的白色克隆都携带重组质粒. Lac 质粒的突变或丢失可能质粒表达α片段的能力.不过这种实际中并不成问题,因为在质粒群体中产生 lac- 突变体的频率远远低于连接反应中产生的重组子的数目.
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