核酸不能凭自己的能力进入细菌,而是需要帮助才能穿过细胞的内、外膜今日细胞内,在那里他们能表达和复制.达到这种目的的方法分为两类：化和物理法.
用简单的盐溶液鸡尾酒法洗涤大肠杆菌能够使其处于感受状态,在这种状态下, DNA 可以进入细胞.现在大部分应用于细菌的化学方法都基于 Mandel 和 Higa 的实验结果,他们发现细菌用冰冷的 CaCl2 处理后,在 37 ℃和 42 ℃加热能够被λ噬菌体 DNA 转染.同样的方法随后也被应用于以质粒 DNA 和大肠杆菌染色体 DNA 细菌.
对于每微克超螺旋质粒 DNA ,这种简单而有效地方法通常能产生 105 和 106 个大肠杆菌的克隆.这对于常规的工作如扩增质粒或把质粒从大肠杆菌的一个菌株转到另一个菌株就足够了.然而当可能得到的每一个克隆都相当重要时,例如,构建 cDNA 文库或只有很少的目的外源 DNA 可以利用时,较高的效率则是必需的.从 20 世纪 70 年代初到现在,文献中描述了许多在此技术上的革新,所有的革新都在试图提高智力细菌不同菌株上下工夫,包括在各种缓冲液中使用不同二价阳离子、用还原型试剂处理细胞、针对大肠杆菌特殊株系的遗传组成调整混合液的成分、在生长周期的特定时期收获细胞、在加化学试剂以前改变培养物的生长温度、热激程度和温度的优化、冻存细胞、用二价阳离子洗涤后再把细胞在有机溶剂下.通过所有这些或更多的处理措施,现在每微克超螺旋质粒 DNA 可获得数量为 106-109 的子.
效率的提高归功于经验主义的实验方法.关于感受状态如何受这些化学试剂盒物理处理的共同,以及质粒 DNA 进入感受态大肠杆菌并稳定传代的机制知道现在还像 Mandel 和 Higa 时代一样模糊.但是,自 20 世纪 70 年代晚期以来,实验方法的改进使效率 vvbuzaishi 克隆中的一个因素而被消除了.
有两条途径可以得到大量化学的大肠杆菌感受态.第一是从商家购买冷冻的感受态细胞,这些产品非常可靠,每微克超螺旋质粒 DNA 通常可以得到多余 108 个子.虽然它们要比实验室指标的感受态昂贵许多倍,但是为了衡量自己大量制备的感受态细胞的效率,商业产品则不失为良好的对照.对于做相当少的研究者来说,自己花精力去制备感受态是不经济的,那么商品化感受态简直是的礼物.另外,许多公司出售带有遗传标记的大肠杆菌菌株感受态细胞,它们在克隆中有特殊的用途.例如： 1.SURE 菌株,其携带的突变使 DNA 修复途径中的某些真核生物的基因组序列不能发生高效重排; 2. 缺失甲基化酶的菌株(如 Dam 和 Dcm ),在这些菌株中繁殖的质粒能被酶切割,但由于重叠的 Dam 或 Dcm 位点的甲基化,则通常不会被酶切割.购买这些生长和均很困难的菌株的感受态是很值得的.
对于使用标准大肠杆菌菌株的实验室,自制大量的感受态细胞是可取的.方案 23 中描述的高效的方法,大肠杆菌 K-12 菌株如 DH1 、 DH5 和 MM294 常适用的,所制备的感受态细胞既可以立即使用也可以小量分装后贮存于 -70 ℃备用.如果谨慎制备,这种细胞对每微克超螺旋质粒 DNA 能产生 109 个子.方案 24 中所描述的用室温培养制备“超感受”细胞的方法也能达到同样的效率.但是,如上所述的高效方法并不常用,对于大多数常规克隆工作,制备感受态时采用更为简单的方法已经足够.一般来说,制备感受态的方法越复杂,结果越不稳定.本章关于的最后一个实验方案(方案 25 )几十一种稳定、有效的方法,有每微克超螺旋质粒 DNA 可获得 105-107 个子.
当大肠杆菌在电荷中石,其细胞膜会不稳定而被形成暂时孔洞,于是 DNA 可由该孔进入细胞.这种电击的方法最初是用来 DNA 进入真核细胞的,随后又被用于质粒大肠杆菌和其他细菌.这是 DNA 细菌的最简单.最快捷、最有效和重复性最好的方法.
通过优化各种参数包括电场的强度、电脉冲长度, DNA 的浓度和电击缓冲液的组成能够获得每微克 DNA 超过 1010 个子的效率.
电穿孔可使培养液中 80% 以上的细胞成氨苄抗性,关于用此方法使每质粒 DNA 的效率达理论最大值的研究已有报道.
对于 2.6-85kb 的质粒,其效率可达到没微克质粒 DNA 获得 6*1010-1*107 个子.这比通过化学方法制备的感受态细胞的效率高 10-20 倍.如此高的效率对于构建大而高度复杂的 cDNA 文库尤为有用.
与化学方法不同,用电穿孔方法产生的子的数目是标记依赖性的.例如,当携带两种抗性基因(氨苄青霉素和四环素)的 pBR322 用该法大肠杆菌是,四环素抗性的子大约比氨苄青霉素抗性的子少 100 倍.这种效果在用化学方法质粒的时候是不存在的.一个可能的解释是,由电击引起的损害或去极化或延缓了与四环素抗性相关的逆向蛋白插入细胞内膜的过程.
当然,电击的简易和效率是有代价的.电穿孔是一种昂贵的商业投资,需要昂贵的电子设备和极高价格的特殊杯子.但是,对于许多研究者而言,该法重复性好和简单易行,是最好的选择.
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