在质粒DNA的分离纯化前的培养过程中,根据pCDNA3为松弛型质粒,复制启动不受宿主细胞的蛋白影响,因此用加入蛋白剂(氯霉素 170ug/ml)的方法处理使染色体DNA复制受阻,质粒却继续扩增,从而获得高拷贝的质粒DNA.
在提取质粒DNA时,对于小的质粒可用煮沸、碱处理、SDS等剧烈的方法,但较大的质粒易受损,应采用温和裂解法,将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,用溶菌酶和EDTA(乙二胺四乙酸)处理,细胞壁和细胞外膜,再加SDS(十二烷基磺酸钠)一类去污剂溶解球形体.要获得大量的质粒DNA关键是裂解寄主细胞.如果寄主细胞没有完全裂解,就会显著降低质粒DNA的回收率.理想状况是是每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出,又没有污染过多的DNA.我们实验时尽量使操作谨慎仔细,使细胞裂解反应温和,以得到清亮的裂解液.但尽管如此,裂解液中除质粒DNA外仍含相当数量片段化的DNA,因此还需其他操作步骤进一步清除杂质,达到纯化DNA的目的.
分离过程中,加入溶液III静置后沉淀细胞碎片及成网状的染色体DNA时,多次实验发现根据参考书目上用8000g离心效果不够好,裂解液中仍有少量悬浮杂质.适当加大离心力到10000g既可以很好地沉淀杂质,又不影响质粒DNA的回收.在用PEG纯化时,为了便于纯化可将大量化成小量,即将1ml的TE溶解物分装在两个1.5ml的Ep管中以便于操作,所用试剂量也酌减,既方便又不影响纯化效果.并且在纯化前后分别测OD260和OD280.计算OD260/OD280,估计质粒DNA的纯度与琼脂糖凝胶电泳结果对照参考,发现纯化后RNA和蛋白质已基本除去,质粒DNA纯度大大提高,
多年来氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心成为制备大量质粒DNA的首选方法.然而该过程昂贵又费时,因此又发展了许多替代方法,如离子交换层析、凝胶过滤层析分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法.但现在看来最好的方法是聚乙二醇沉淀法.用此方法可得纯度较高的质粒.其优点如：再沉淀DNA时,能使DNA与盐结合的少.但它也有缺点,那就是不能把带切口的环状同闭环质粒DNA分开,纯化后在琼脂糖凝胶电泳中可见清晰的两条带.在用LiCl沉淀后的杂质中加TE溶解电泳发现其中不仅有段RNA而且有质粒DNA,另外在操作过程中机械力过大会使DNA断裂,这些地方都需要改进.
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