大 DNA( 一般长度超过 20kb,在某些情况下,超过 40kb) 在电场作用下通过孔径小于大小的凝胶时,将会改变无规卷曲的构象,沿电场方向伸直,与电场平行从而才能通过凝胶.此时,大通过凝胶的方式相同,迁移率无差别(也称“极限迁移率”),不能分离.脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题,它应用于分离纯化大小在 10 ～ 2000kb 之间的 DNA 片段.这种电泳是在两个不同方向的电场周期替进行的, DNA 在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于大小, DNA 越大,这种构象改变需要的时间越长,重新定向的时间也越长,于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少,因而在凝胶中移动越慢.反之,较小的 DNA 移动较快,于是不同大小的被成功分离.在许多实用的 PFGE 方法中,倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法 (FIGE).通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上,倒转电场凝胶电泳 (FIGE) 设备能把大小范围在 10 ～ 2000kb 的 DNA 片段分开. FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场,这样会进一步扩展其分离极限达到 10Mb.
为避免大 DNA 在提取过程中断裂,细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解,在本实验中,我们使用金葡萄球菌 (StapHylococcus aureus) 作为例子.
3) 取 1.5mL 细胞样品与相同体积含 2%SeaPLaque 琼脂糖的 EC 缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于 4 ℃ 凝固,混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至 50 ℃.
提高 PFGE 的分辨率取决于 100 ～ 1000kb 片段电泳结果的重复率,它与酶切关系密切,可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化.
2) 取一个凝胶块置其中,合适温度下温育过夜(按内切酶要求)后,用 TE 缓冲液洗涤并贮存.
2) 胶凝后,小心移去样品梳.将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小,将样心地插入加样孔,避免产生气泡.(若样品在溶液中,以 l:1 的比率与 50 ℃ 2%Seaplaque 琼脂糖相混合,迅速注入加样孔中 ).
4) 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连.打开电源,调节蠕动泵到适当流速 (5 ～10mL/rain) 或打开变速泵至 40.
5) 通过计算机启动极性转换程序.大于 50kb 的性片段在 1.2s 和 0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离,时间一般为 3.5h 或更长.小于 50kb 的性片段在 0.4s 正向和 0.2s 反向的电脉冲(比率为 2:1) 下得以分离,时间为 3 ～ 5h.
1) 凝胶染色、分析后,在目的带前(靠近正极处)切一个0.25cm2 左右的槽,注入 0.8%Seaplaque 琼脂糖,使之凝固.
2) 重新打开极性转换开关,用紫外递质检测 DNA 的迁移,当目的带进入 Seaplaque 凝胶中时,关闭开关,切下目的带,移至1.5mL EP 管中.
3 、用蛋白酶K 包埋的材料时 50 ℃ 温育时间很长 (24 ～48h),有些学者提出如此长时间不必要 (Mortimer et al.1990),且可能造成高质量 DNA 降解.在实验中可视情况而定.
5 、一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳,因为这些电源设计时均带有电,它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭.
6 、由于电压较高,就会产生热量,为了温度为 14 ℃,需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或 MiniChiller).此外,把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温.
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