在 20 世纪 90 年代,许多从事克隆的工作者,尤其是年轻人,极喜欢用商品化的层析树脂(大多以试剂盒的形式销售)纯化质粒 DNA .这一现象及其普遍.其实,用常规技术分离纯化质粒 DNA 并不见得更费劲,而且也没有令人信服的表明,经典的或过时的质粒制备技术一定比商品化的试剂盒落后.那么,克隆工作者们究竟为森美宁愿使用这些价格昂贵又不知其具体成分的试剂盒呢,而不使用那些早已被证明可行且只适用已知简单成分的成熟方法来纯化质粒呢?原因之一恐怕是商家持续不断的广告引导.商家总是千方百计使年轻的克隆工作者们相信,使用他们的试剂盒能够使其成为一个更加出色的科学家.虽然这些试剂盒也可能导致实验的失败,他们仍不愿意采用常规的质粒制备方法来避免其面对这样的一种尴尬处境：使用试剂盒出现某种问题时再责备厂家.
当然,试剂盒的发展也有积极的一面.商家的试剂盒也的确在不断地改进和优化质粒克隆的方法.在过去,小量制备质粒通常采用溴化乙锭 - 氯化铯密度梯度离心的方法.当进行 DNA 操作的酶远没有现在的可靠时,要想得到所需末端的 DNA 片段并与载体连接确实相当困难;获得相当多的阳性重组子不是一件容易的事.并且时由载体本身形成的菌落数与由连接反应获得的菌落数往往几乎一样多.另外含有重组质粒的阳性子通常需通过杂交或繁琐的多次小量制备分析来进行鉴定.过去每分析 100 个菌落以上仅获得一个阳性克隆的情况屡见不鲜.冷泉港实验室 1981 年有记录表面,一个人完成 168 个小量制备实验要用一天的时间.然而在今天,由于试剂盒的普遍使用,这一数字已不足为奇.
今天,即使那些所谓“困难”载体,其克隆也能快速有效.高拷贝数载体的出现使我们已无须进行大规模细菌培养.引物试剂盒功能的不断改进,小量制备的质粒 DNA 的质量如此的好,使得利用密度梯度离心进行常规质粒纯化技术已不再必要.我们在此阐述利用层析技术纯化质粒 DNA 的一般方法.操作步骤见每种试剂盒中的说明书.下面还对这些试剂盒的工作原理做进一步说明.
试剂盒中的层析树脂一般分为两大类.一类树脂纯化的质粒 DNA 其纯度足以用于酶操作(如 PCR 、酶反应和连接反应)、原核细胞,但不适用于真核细胞转染;另一类纯化的质粒 DNA 适用于以上所有用途.两种树脂都可以从细菌裂解液中纯化 DNA.
商品化树脂的化学结构大都很独特.这就意味着,一般人无法低成本合成实验室使用的树脂.一般来说,树脂的工作原理分两种 : 一种是利用疏水反应纯化核酸;另一种是利用混合离子交换及吸附反应进行纯化.后者是制备用于转染真核细胞的质粒 DNA 的最常用的方法.有关这一类树脂的研制过程还有一段有趣的故事.
早在 20 世纪 50 年代,人们就已知道,在有离液盐存在时 DNA 能与硅胶可逆结合. DNA 双链与硅化材料相互作用的原理被认为是由于 DNA 中磷酸二酯链骨架在离液盐作用下脱水,湿的的磷酸集团吸附硅胶.双链的 DNA 一旦被硅胶吸附,则以天然状态或部分变性状态(单链)存在,不能用洗脱 RNA 或碳水化合物等生物大的溶剂(如 50% 乙醇)将其洗脱下来.但是,经水溶性缓冲液 ( 通常为 TE 或水 ) 重新水化后, DNA 就能从层析柱上定量回收.进入 20 世纪 80 年代,由于 Promege 公司的化学家 Chuck YorK 以及其他生物学试剂公司的化学家们在此方面的大量基础研究,导致目前商品化的树脂的普遍使用.
双链 DNA 和硅胶的吸附作用依赖于 DNA 的碱基组成和拓扑学结构.树脂本身的特点使其成为纯化环状质粒 DNA 及长链线状 DNA 片段的理想材料.但是 DNA 与硅胶的相互作用还依赖于 DNA 的长度,小于 100-200bp 的 DNA 片段很难媳妇到树脂上.正由于这一原因,目前市场上的硅胶色谱纯化试剂不能用于小片段 DNA 的纯化.
纯化质粒所需要树脂的量取决于细菌裂解液的量.目前市场上可购买到的纯化质粒 DNA 的试剂盒有三种规格,分别用于 DNA 的小量制备( 1-10ml 菌液)、中量制备( 10-100ml )和大量制备(多于 100ml ).市场上既有由用户自己装配的散装树脂,也有可直接用于纯化的预制柱.厂家还可提供针对该树脂的结合、洗涤及洗脱所需要的各种缓冲液的化学成分.不过,购买散装树脂并自己制备缓冲液显然是一种省钱的好方法.另有几家公司还提供与预制柱配套的真空管装置,能够同时小量提取 96 个样的细胞培养物的质粒.
每个厂家都为其树脂配有详细说明书.因为质粒 DNA 与树脂的结合及洗脱依赖于树脂的结构和衍生化作用,所以使用时必须严格遵循厂家提供的说明书的操作方法.
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