若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒DNA,无菌的碱裂解液I在使用前可补充适当体积的去DNA酶的RNA酶A(胰RNA酶)(20mg/ml),使之终浓度为100ug/ml,若欲用其他的方法纯化DNA,则不推荐在此步骤添加RNA酶.
细胞的制备1、挑后的单菌落(或用0.1-1.0ml单菌落的培养物),接种到30ml含有适当抗生素的丰富培养基中(LB、YT或Terrific培养液),于37 ℃剧烈振摇下培养过夜.确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养液的体积大4倍.试管不宜盖紧培养物应在剧烈振摇下培养.2、在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期(OD600约为0.6).3、在含有500mlLB 、YT或Terrific培养液(预热37 ℃)及适当抗生素的烧瓶(2L)中接种25ml对数生长期晚期的菌液.将此培养液在37 ℃剧烈振摇(300r/min)培养约2.5h .菌液的 OD600 应约为0.4. 由于不同菌株的生长速度不同,可稍微延长或缩短培养时间,使最终的OD值为0.4.4、若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒,在培养液中添加2.5ml浓度为34mg/ml的氯霉素,使其终浓度为170ug/ml.重要：对于高拷贝数的治理,不必添加氯霉素.5、于37 ℃,以300r/min剧烈震荡再培养 12-16h .6、取部分菌液( 1-2ml )到离心管中, 4 ℃贮存.于4 ℃,以 2700g (对于 Sorvall GSA 转子时4100r/min )离心 15min 以收集余下的近 500ml 培养物.弃上清,倒置离心管使的上出.7、用200ml 冰预冷的STE 重悬细菌沉淀,按步骤 6 所述重新收集细菌并贮存在 -20 ℃.8、用步骤 6 贮存的 1-2ml 菌液提取质粒(可使用方案 1 或 4 中的任一种方法),采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒,以确定大量培养菌液确的质粒已得以扩增.设置这种对照可能看上去优点过于谨慎,然而它可以避免发生某些可能难以的、浪费大量时间的错误细胞的裂解9、将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5-10min使其解冻后,用18ml(10ml)碱裂解液 I 重悬.只有步骤4使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数.10、加2ml(1ml)新配置的10mg/ml溶菌酶.11、加40ml(20ml)新配置的碱裂解液Ⅱ . 盖上离心管盖,轻轻数次,彻底混匀,室温下放置5-10min.延长超螺旋 DNA 于碱的时间会使其不可逆变性,所产生的环状卷曲DNA不能被酶切割,而且他在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的两倍,难以被溴化乙锭染色.从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种DNA.12、加20ml(15ml)冰预冷的碱裂解液Ⅲ. 盖上离心管盖,轻轻地但完全地振荡混匀几次(此时应不再有分离的两种液相).将离心管在冰上放置 10min .在放置过程中会出现有染色体DNA、高质量RNA 、钾离子/SDS/蛋白质/ 细胞壁复合物一起星辰的乳白色沉淀.在碱裂解液Ⅲ中最好使用醋酸钾而非醋酸钠,因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶.13、在 4 ℃用 20000g 离心碱裂解液(或Sorvall GSA转头,11000r/min)30min, 无须制动,让转头自动停止.将上清轻轻移入量筒中,弃去离心管中的沉淀.不能形成紧密的沉淀的原因常常是加入裂解液Ⅱ时混匀不充分(步骤 11 ).如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀,以20000g(Sorvall GSA 转头, 11000r/min )再次离心15min,然后将上清尽量移入干净的离心管中.转移的时间使用四层纱布过滤上清可以出去黏稠的基因组DNA 和蛋白质沉淀.
质粒DNA的回收14、量取上清的体积,将其连同0.6倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀,室温下放置10min .15、在室温下以12000g(Sorvall GSA 转头,8000r/min)离心15min回收核酸沉淀.若在4 ℃下离心也会使盐也沉淀下来16、小心弃去上清,将离心管敞开盖,倒置于纸巾上以除去的上清.在室温下用70%的乙醇刷洗管底及管壁,倒掉乙醇,并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴.将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉.如果用干燥器或真空干燥的的方法干燥 DNA 沉淀,在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性.将沉淀在室温下干燥10-15min对于乙醇挥发来说已经足够了,而且不会引起 DNA 脱水.17、用 3mlTE(ph8.0)溶解湿润的核酸沉淀.18、粗制质粒DNA的纯化可用柱层析法,聚乙二醇沉淀法或CsCl-溴化乙锭梯度离心法.19、用酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构.
煮沸法裂解法制备质粒DNA方法[根据Holmes和Quigley的方法修订而成]是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100 ℃使其裂解.加热除了细胞外壁, 还有助于解开 DNA 链的碱基配对,并使蛋白质和染色体 DNA 变性.但是,闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构.当温度下降后,闭环DNA 的碱基又各就各位,形成超螺旋.离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA.裂解法对于小于 15kb 的小质粒很有效,可用于提取少至1ml(小量制备),多至250ml(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用.但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用该法.这是因为碳水化合物很难除去,会酶和聚合酶的活性.若碳水化合物的量很大,在 CsCl- 溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊碧清.大肠杆菌菌株HB101及其衍生菌株(其中包括TG1) 能产生大量的碳水化合物,不适合用煮沸法裂解.表达酶A(endA+ )的大肠杆菌菌株(endA+ 株),也不推荐使用煮沸法提取质粒.因为在煮沸过程中,酶不含完全失活,而在后面的操作步骤中难免有Mg2+存在(如性内切核酸酶的酶切过程),质粒DNA会降解.因此应当采用碱裂解法提取endA+菌株的质粒.模煮沸裂解可被扩大而用于提取大体积菌液的DNA.经这种方法分离的DNA可用聚二乙醇沉淀法、柱层析法或 CsCl- 溴化乙锭梯度离心法等方法提纯.不过,只有用氯霉素处理过的菌液才推荐使用这种方法,未被氯霉素处理过的菌液产生的裂解液太黏,难以处理.相关阅读：
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