质粒提取：质粒的提取

　　质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,它在基因操作中具有重要作用.质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术.

　　质粒的提取方法很多,大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA的分离和纯化.本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程.

　　实验材料：含有质粒 pUC18 载体的大肠杆菌菌液,克隆有水稻外源片段的 BAC 的大肠杆菌菌液.

　　实验原理：在 pH 12.0 ~ 12.6 碱性中,细菌的线性大量染色体 DNA 变性分开,而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态.将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体 DNA 、大量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀,而质粒 DNA 仍然为可溶状态.通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质,质粒 DNA 尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA .

　　2、用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中, 37 ℃ 摇床 ~250 r/min 过夜培养;

　　4、加入 300 ml 溶液 I 振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意：应彻底打匀沉淀或碎块);

　　8、吸取 800 ml 上清液(注意：不要吸取到飘浮的杂质)至另一 Eppendorf 管中,加入 2/3 体积的异丙醇,室温下放置 5 分钟;