1、 消化一定量DNA以收获至少loong目的片段DNA.用含有0.5ug/ml EB的适当浓,度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段.用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位.
EB-DNA复合物的激发会导致染料的光猝灭以及单链DNA的.用302nm擅长光源取代254nm光源将会降低这两种危害.
如果需从整个琼脂糖泳道上洗脱DNA(如哺乳动物细胞基因组DNA的酶消化物),在凝胶上与目的泳道平行的做一切口,在切口处插入一长条 DEAE 纤维素膜(同步骤3) .调整凝胶的方向使DNA可以从凝胶中电泳转移至膜上.电泳结束后,取出膜,切成小片.从适当的膜段上洗脱所需大小的DNA(步骤7-11)
5、继续电泳(5V/cm)直至DNA条带迁移到膜上.电泳过程中,可以用手提式长波紫外灯(302nm)进行检测.
继续电泳的时间尽可能短,只要DNA从凝腔中转移到膜上即可.过长时间的电泳会导致其他 DNA 的交叉污染(见上文)和琼脂糖中污染物不必要的累积.
6、当所有目的DNA离开凝胶被收集到膜上时,切断电流.用平头镊子从凝胶中取出膜,室温下,用5-10ml DEAE低盐缓冲液将膜漂洗一下,以除去膜上的琼脂糖.
7、将膜转移到另一个微量离心管中,加足量的DEAE高盐洗脱缓冲液使膜完全被浸没.轻轻的将膜弄皱或对折,但不要压紧.盖上离心管盖,于65℃温育30min.不时地检查,不要让膜伸展到缓冲面上.
9、步骤7的液体转移到另一微量离心管,再加入足量的DEAE高盐洗脱缓冲液65℃ 温育15min.合并两份DEAE高盐溶液.
10、高盐洗脱液用酚：氯仿抽提一次.水相转移到另一离心管.加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵,2倍体积的4℃乙醇.室温放置10min.用微量离心机室温以最大转速离心10min.用70%乙醇小心洗沉淀.打开离心管几分钟,使乙醇完全挥发.再将DNA重溶到3-5ulTE(pH8.0).
在沉淀以前加入10ug转移RNA.可以改善少量DNA回收的效果.但是在加入载体 RNA 之前必须确定RNA不会影响DNA以后作为底物或模板的酶促反应.
11、如果需要极纯的DNA(如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔照下述方法用乙醇再沉淀DNA.
12、通过凝胶电泳对DNA进行定性和定量.将少量 (10-50ng) 最终制备的DNA片段与10ul TE(pH8.0)混合,加入2ul所需的凝胶载样缓冲液.
加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳,以已知量的经用适当酶消化的原 DNA 作为参照物标准和质量标准.分离的片段应该与酶消化产物中的相应片段同步迁移.仔细检查凝胶,看是否有弱荧光带存在.弱荧光带存在表明有DNA污染.
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