选择3~5轮后,随机挑取克隆加入96孔微量滴定板中并表达可溶性scFv.然后,在包被有相关抗原的96孔微量滴定板中,用ELISA分析含有可溶性scFv的细菌上清.此过程可以识别出那些结合了抗原的scFv.但即便采用上述严谨性选择后,ELISA阳性克隆中仅有部分克隆的亲和力比野生型高.ELISA信号强度不能很好地显示哪个克隆具有较低的Ka值,而且更为普 遍的是它与scFv表达水平相关.因此,这就需要一种筛选ELISA阳性克隆的技术,能识别出具有较低Ka值的克隆.竞争性或性ELISA就是这样的技术.或者可以利用以下事实:koff降低一般是导致高亲和力提高的主要动力学机制,因此通过测定解离速率就可以识别出那些亲和力得到提高的抗体.因为κoff浓度依赖的(不同于kon,),所以无需纯化抗体片段就能测定κoff,比如采用类似BIAcore的仪器进行SRP分析.我们已发现这是鉴别高亲和力scPv的一项很有用的技术,还可以以此来评分亲和力成熟了的克隆的等级.
首先,我们用ELISA识别出结合性克隆.然后,随机挑取20一50个选择的ELISA阳性克隆;根据κoff大小排队比较.再选出那些κoff最低的克隆进行亚克隆、纯化,并用BIAcore进行SRP测定其Kd值.需要注意的是,在scFv情况下,解离曲线形状可以出是否存在单个或多个κoff值.有多个κoff值的scFv(当以R1/R0对于作图时,出现一条曲线对一条直线)是单体和二聚体的混合物,最好避免用于续后的研究.
4、准备外周质提取物.用200u1 PPB缓冲液重悬细菌沉淀,将沉淀悬液转移到1.5m1试管内,放于冰上20分钟;这会使细胞皱缩并提取部分scFv蛋白;加入低渗性MgCl2使外周质处于高渗状态促进肿胀.用微型离心机沉淀细胞,6000r/min 5分钟.弃去上清.细菌沉淀部分将用于渗透压休克的制备.
5、准备渗透压休克组分.用200u1 5mm01/L MgSO4重悬沉淀并在冰上孵育重悬沉淀物20分钟.用微型离心机全速(14000r/min)离Jc沉淀细胞5分钟.取1支新试管保存上清,即为渗透压休克组分.
6、用CentriSep柱将含有scFv的渗透压休克缓冲液换为Blacore运行缓冲液(HBS),操作按厂家所述进行.
7、根据厂家说明书装配Biacore仪.在Biacore仪流动池内,用EDC/NHS化将靶抗原固化在CM5传感芯片上,操作按厂家所述进行.
8、将步骤5所制备的scFv样品注入到流动池内,1分钟.而后,保持15u1/min的恒定流速,用HBS作为运行缓冲液,观察解离相2一10分钟.
9、再生芯片的表面,并进行下一个scFv分析.可以编写程序使此过程自动进行,使40~50个scFv的数值能自动进行过夜分析.使用Biacore厂家提供的软件,可对每个所分析的scFv自其图的解离部分测定出表观κoff值.
经过上述分析后,就能根据Aof/值高低将克隆依次排列.然后,纯化解离速率最低的scFv并测定其Kd值.这种载体附加了C末端六组氨酸标签,因此,用固相金属亲和层析(IMAc)从外周质中纯化出scFv.而这对于那些在已含有六组氨酸标签的噬菌体展示载体中的克隆来说,却无必要.而后,用胶过滤方法去除凝集的和二聚化的scFv,用BIAcore仪进行SPR测定κon值和Aoff值,再以此计算出Kd值.
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