要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?
① 免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以性检测某个蛋白质,进行定量,但是不能定位.
② 两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片.
这首先要从抗体的产生来探讨.把某一抗原免疫某种动物而得到单抗或多抗.如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞,则得到单克隆抗体,如果用动物的血清,则得到多克隆抗体.但从理论上说,这些抗体都应针对抗原来自的动物,例如如果用人蛋白抗原免疫小鼠,则这些抗体为鼠抗人.由于一个大蛋白表面具有多种抗原决定簇,因此,免疫动物后,这些不同的决定簇分别动物产生不同的抗体,每种抗体的性不同.单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的,所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇,而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的,是多种细胞的混合物,但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇.多抗混合物中的每一抗体与蛋白抗原结合的能力是不同的,因此用多抗做实验与用单抗可有其优势,那就是能确保抗体与抗原结合从而显示抗原信息.但也有其缺点,那就是交叉反应,往往造成假阳性.从理论上说,用人抗原产生的抗体应只能用于人类,但由于动属之间,特别是相近的动物之间,如人与猩猩,大鼠与小鼠存在着同源性,导致抗体的交叉反应,即用一种动物抗原产生的抗体也可与其它一些动物的抗原反应.一般在商品化的产品说明书上都有说明.由于单抗只针对单一抗原决定簇,因此,其能导致的交叉反应很少,而多抗是混合物,导致的交叉反应就多一些.但并不是向你所认为的那样,多抗可与所有种属动物反应.在选择抗体时,如果你标本来源于人,当然应选用如鼠抗人或兔抗人等.如果抗体来源确实不清,那应该先预实验.选择已知阳性标本,在充分设置阴性对照的前提下,用此抗体染色,看能否显示阳性结果.
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