摘要：许多蛋白质在其表面含有较多的赖氨酸残基.这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC共价结合.
许多蛋白质在其表面含有较多的赖氨酸残基.这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC(其激发波长为492nm, 发射光波长为525nm)共价结合.与FITC结合的抗体可用为性的探针,以测定细胞相应抗原的存在.FITC具有很高的量子产量(发射光与吸收光的比值,0 .85),而且形成的偶联物的稳定性很好.FITC是应用最广的荧光染料,流式细胞仪就按FITC的特性,设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm).
偶联反应是在pH 9.8条件下,赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应,由此形成硫脲连接.
1.用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml,或抗体对该缓冲液充分透析,以足以使赖氨酸不解离(去其正电荷),但注意保持大部分蛋白质仍未变性;
2.将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液(新配制)的烧杯中,用铝铂包烧杯以避光,4℃搅拌过夜;
3.上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应.其间至少更换PBS液三次,直致480nm 的吸收为零;
2.要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基(Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应,因此会降低蛋白质与FITC的偶联率);
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