摘要：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段.下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍.
随着研究的进展,仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要.在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比.目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、性稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)和单细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞,此方法可获得较强的细胞内信号,但此方法工作量大、主观性强,难以进行大样本检测,且人识别能力有很大的局限性,而ELISPOT及单细胞PCR技术,技术性强、劳动强度大,难以进行广泛推广.随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段.下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍.
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活.尽管研究应用T淋巴细胞克隆">克隆证明了不同细胞因子的合成,如TH1(IL-2,IFN-)与TH2(IL-4,IL-5,IL-10),但这些研究很难外推,因为T细胞克隆">克隆与体内T细胞功能相关性还未被.
近来,Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵,用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测.因为自然状态下,T淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究.在体外刺激过程中,T淋巴细胞产生的细胞因子已出来,胞内细胞因子信号较弱,难以进行检测.这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子,并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群.在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化,且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转.且这些研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子.
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学与抗体选择,确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景.具有其它方法难以比拟的优点：
快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成,实验流程需6-8小时,实际操作时间为1-2小时,快速简便;
高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析;
全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血,不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%.如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置.
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后,分离PBMCs,24小时内分析.
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs,将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中,调节细胞浓度为2×106细胞/ml.
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs,用PBS漂洗,并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬,-70℃冻存.溶化后细胞置于染色管中,加上2～3mL的洗液,离心5分钟后,用破膜剂对细胞进行破膜和染色.
细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定.固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内,另一方面避免细胞表面抗原丢失.含4%的多聚甲醛PBS溶液(eBioscience,目录号00-8222)
细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果.下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法.
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运剂(如3uM monensin,10mg/ml的BFA)
[/strong] 肝素钠抗凝的静脉血,按1：1与培养基混匀,加刺激剂,同时加蛋白转运剂(参照说明书), 混匀后,37℃,5%二氧化碳培养4-6小时
① 在小鼠,可使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32),按照1ug/106细胞的用量,在染色缓冲液中4℃孵育15分钟,PBS清洗后,直接进行下一步染色.
[/strong] 避免使用络合钙的抗凝剂,如ACD与EDTA,因为它们会钙依赖性激活过程,推荐用肝素钠.此外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会混淆试验结果.血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%.如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置.
[/strong] 检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间,以最佳的检测效果.比如,要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激;如果用CD4做表面标记,由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调,所以培养时间不能太长,4-6小时为宜,否则CD4下调影响分析
激活时由于BFA的存在了胞内蛋白的转运,因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内,未刺激对照也应包含BFA.
激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染,需制备新鲜刺激剂重新实验.
使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非性结合到细胞表面而产生的背景染色.
[/strong] 使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非荧光染色,在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32(eBioscience, 目录号14-0161-81),在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32,在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清.
[/strong] 检测相对低表达细胞因子如IL-4时,应选用PE或APC标记;单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记;同时检测多种细胞因子时,弱表达的应选用PE或APC,FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ.
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