摘要：当光线通过一个浑浊介质溶液时,由于溶液中存在混浊颗粒,光线被吸收一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比,这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法.
当光线通过一个浑浊介质溶液时,由于溶液中存在混浊颗粒,光线被吸收一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比,这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法.这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物,导致浊度的改变,再进行透射比浊测定,一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法,称为免疫透射比浊法.其原理是,利用抗原和抗体的性结合形成复合物,通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法.
①对抗体的要求,作为体液或组织中蛋白质种类很多,若要快速检测,要求有单价抗体才能与抗原形成复合物.某一种蛋白质,有其抗体才能与该抗原结合,形成免疫复合物进行定量,若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体,这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩,结果偏高;
②抗原抗体比例适当,因免疫复合物形成有三个阶段,第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物;第二 阶段是初步形成抗原抗体复合物,此阶段是复合物交联成大的网格状结构;第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀.只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体,此时,复合物的结合与解离处于平衡状态,其混浊程度达高峰.在抗体过量时,随抗原量的增加而复合物形成也增加,其测定只能在反应曲线);
③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成,如聚乙二醇6000等.溶液pH为6.5～8.0之间为宜.载脂蛋白有形成两性螺旋片(amphipathic helix)的特性,对脂质(特别是磷脂)有高度亲和力,与脂质结合后有时会抗原位点或构象改变,可以部分或完全对抗血清的反应.为此,载脂蛋白检测过程中有必要先抗原位点,所用试剂有表面活性剂,尿素,盐酸胍和吐温等解离蛋白剂,或用四甲基尿脱脂或有机溶剂脱脂等抗原决定簇等方法,血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白,能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量;
④抗原不能过量,因为抗原过量,抗原抗体复合物形成不但不增加,反而会减少,光散射或光吸收减少,检测结果反而偏低.
在免疫比浊过程中,由于抗原抗体结合的三过程,从而导致光密度与浓度之间不呈线次方程曲线关系.若将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来,需要经过3次方程拟合成近似直线化的曲线方程,再进行运算,免疫比浊中,采用终点法或速率法,用5个或7个不同梯度进行定标,经3次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与光密度的关系曲线方程,才能作为定量的工作曲线.
脂蛋白抗原在溶液中与相应抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒,分散于溶液介质中,在一定波长下测定其混浊程度,进行ApoAⅠ(B100)的定量测定.
(1)按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl,加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂(Apo抗体液).最好临用前配制当天用量.
混匀各管,37℃保温10min,波长340min,于半自动分析仪上先吸入空白管液,再吸入标准管,仪器根据光密度及参考值得出一换算系数,再吸入测定管,仪器内根据光密度及系数进行运算,打印结果.
(3)定标方法,根据免疫比浊法原理,应取多点(3～9点),按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回归曲线进行定标,制作参考工作曲线.
配制抗血清稀释工作液:按RⅠ试剂0.9ml,加RⅡ试剂100μl的比例(Apo抗体液)混匀,待用.
制备5点校正液:取RⅢ(参考血清),用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度,第5管为原参考血清浓度,其它4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16(或浓度为0即0.9%NaCl).
吸待测血清(测定管)5μl,加上述稀释抗血清工作液1.0ml,于37℃水浴保温10min,上机读数,打印结果.
脂蛋白抗原在溶液中与相应抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中,在一定波长下测定其混浊程度,进行ApoAⅠ(B100)的定量测定.
(2)标本及试剂用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相应的Apo缓冲液(RⅠ)0.3ml的比例混合成单一试剂(Apo抗体液).最好临用前配制当天用量,此抗体液置2～8℃保存一周有效.
从理论上考虑任何一种生化测定方法的试剂,临用时混合最好,可以消除试剂各种成份的自身化学变化和相互影响.而在实际工作中,是不可能的,只能是将几种不会 起化学反应而又无相互影响的试剂配制成2～4种,临用时按一定比例配制使用.临床化学试剂盒,目前主要以1或2种试剂形式供医学检验使用,即单一试剂和双试剂两种形式.
笔者认为双试剂比单一试剂好,尤其是含酶试剂和免疫试剂以双试剂包装形式为好,有利于对酶的活性或抗体效价的保存.单一试剂是所有试剂混合在一起,存放过程中,有可能因化学物质的存在而损害试剂中的工具酶或抗体,存放时间越长,损害可能性越大,然而双试剂不存在这一问题.
对脂质的测定双试剂法更显其优越性,因为血清中脂质与载脂蛋白是以脂蛋白的形式存在,当测定试剂与血清标本混合后,首先解联脂蛋白,让其出脂质和载脂蛋 白,.作为免疫测定试剂还兼有使载脂蛋白抗原决定簇的作用.当R1试剂作用完后,加进第二试剂(R2)后,使其抗体适应抗原决定簇的要求,达到抗原抗 体结构呈完全的互补状态,从而产生最大的抗原抗体结合量,达到定量的目的.双试剂测定法,既能自动扣去空白,又能使化学反应快速进行,从而迅速地完成检测的全过程.
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