摘要：在免疫染色法中,最大的问题也许是抗体与所研究的蛋白质之外的其他物质发生交叉反应,这是一个非常严重的问题.
在免疫染色法中,最大的问题也许是抗体与所研究的蛋白质之外的其他物质发生交叉反应,这是一个非常严重的问题.标本中抗原表位非常复杂,包括细胞内所有蛋白质,而且每种蛋白质可能存在不同的变性程度.固定后抗原的这种特性非常适合于低亲和力反应.这时可以观察到许多蛋白质的局部浓度非常高,因为它们被固定于基质中.局部高浓度的抗原将有助于低亲和力抗体与抗原结合,但同时也增加了交叉反应的可能性.另外,用这种方式固定的,抗原与抗体测试时所使用的抗原在形式上是不同的.所有这些问题,即不同程度的变性显示出的大量抗原表位,使得不能采用简单方法来选择最合适的抗体;以这种方式固定的抗原能够增强低亲和力的反应,从而使选择正确的抗体在免疫染色中成为一个重要问题.没有一个理想的方法来选择不发生交叉反应的抗体,但是通过设置对照实验有助于选择最好的抗体.
这是所有免疫染色实验中的基本步骤之一,能够确定所用抗体的特性.比较对照抗体和实验抗体(两者浓度一致)的染色方式.阴性对照抗体应尽可能与所用实验抗体相对应.如果实验抗体为多克隆抗体,阴性对照抗体应来源于同一种动物.如果所用抗体为单抗,则对照抗体应来源于同一种动物的同一类型单抗.对照抗体的染色模式应与实验所用抗体的染色模式不同,如果二者有相同的染色模式,即使着色强度不同,也提示此着色部位不是由于存在相关抗原所造成的.
抗原封闭可检测染色反应是否由性抗体识别抗原所引起.当使用多克隆抗体时,这一点显得尤其重要,因为在抗体来源的血清中,含有很多种非抗原性抗体.在将抗体加入到固定的细胞之前,加入饱和量的抗原到抗体溶液中.如果此时细胞的染色被封闭,则说明实验中的染色结果是由抗原性抗体所致,可以断定染色结果不是由抗体溶液中的其他非性抗体引起.注意在解释这些结果时要小心,因为这些实验只能说明实验结果的性,但不能区分染色结果是由真正抗原引起还是由于交叉反应所致.
在常用技术中,免疫印迹最能反映免疫染色所需的条件.在此项技术中,蛋白质经过变性处理且被固定于固相支持物上.免疫印迹和免疫染色的最大区别是:在免疫印迹中,蛋白质完全变性;而在免疫染色技术中,许多蛋白质仍在很大程度上保持自然状态.另外,在免疫染色法中,细胞仍基本上保持自然结构,但在免疫印迹中,细胞结构却被完全.尽管如此,免疫印迹仍然是免疫染色的良好参照.例如将需要进行免疫染色的细胞处理之后,用100～150rig总蛋白进行电泳,转印至膜上后,用抗体进行染色.理想的实验结果应是显而易见的一条单带,这条带即是将要检测的抗原,提示细胞中不含多种在变性状态下被抗体识别的蛋白质.然而这并不排除结果是由细胞固定导致的交叉反应引起.如果出现多条带,则很可能意味着有交叉反应,并且提示应进一步选择更合适的抗体.
如果使用几种分别识别抗原不同部位的抗体(针对抗原不同区域产生不同抗体或识别抗原不同表位的单克隆抗体),得到的染色结果相似,则说明结果是由所研究的抗原引起.使用2种不同抗体即能提供有力,3种抗体的力更加无懈可击.另外通过使用一些能被商品化抗体识别的标记物质与所要研究的抗原构成融合蛋白也是一种创造多抗体结合点的方法.
滴定抗体的浓度以确定能够产生有明显信号所需的最低浓度,使血清中能够导致假阳性信号产生的物质的浓度降至最低限度.
最基本的实验是检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞.理想的对照细胞是基因敲除鼠的细胞.如果在这类细胞中,不出现相应染色结果,而在同时检测的野生型细胞中仍旧存在,说明染色结果是由抗原所致.如果获得一个抗原缺陷细胞系,可以用基因转染把抗原重新引入这个细胞系,注意确保表达水平与所研究细胞中的表达水平相近.
如果细胞能够被转染并表达所研究抗原的DNA或反病毒,那么,另一种确定抗原的方法是比较原来的染色结果与表达融合蛋白细胞的绿色荧光蛋白显色结果.二者相似则能更加有力地说明性抗原的分布情况,如果两种结果不同,则无法说明问题,并对原先实验结果应持怀疑态度.
综上所述,要想完全确定染色结果是由性抗原所致常困难的.在此所推荐的方法是:用免疫印迹弄清不同抗体的特性,用适当的阴性对照抗体分别检测这些抗体的免疫染色结果,利用识别抗原不同部位或表位的多种抗体,如果有可能的话, 比较GFP融合蛋白的显色结果.如果实验结果被这些精心设置的对照实验所支持,应该能够说明抗原的亚细胞分布情况.
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