阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致,一般阳性对照多以含蛋白剂的缓冲液为基质,加入一定量的待检物质.比如,以人血清为标本的测定,阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品.
阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致,最好先行检测确定其中不含待检物质.比如,检测人血清标本时,阴性对照应该选择正血清;检测免疫动物血清中抗体效价时,阴性对照应该选择该动物的免疫前血清.
包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小抗原三大类.天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被,对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上,再通过性反应使抗原固相化).经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板.小抗原比如多肽以及一些小有机化合物,由于量太小,往往难于直接吸附在酶标板上,一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联,偶联物吸附于固相载体上.
通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时,我们强烈4-8度条件下包被,有利于蛋白活性的保持.
包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化,一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml,要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要通过实验来确定.
封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件.一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果.而在间接法测定中,封闭一般是必不可少的.
常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉,AbMART推荐使用5%脱脂奶粉,价廉而且封闭能力强,不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用,不宜长期保存,所以试剂盒中较少使用.
在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%BSA或5%脱脂奶粉),通过竞争酶结合物在固相载体上的非性吸附.一般还加入能够蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温20(0.05%的浓度较为适宜).
酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定,浓度过高易导致本底偏高,浓度过低则会导致阳性信号的减弱.
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