抗体的生物素化标记可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合.其后,生物素化的可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测.小的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础.
8.将样品上1ml的筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1ml/管,蛋白质在1-3ml之间洗下;
9.最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA.将结合产物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置―20℃保存.
与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素(neutravidin),通过标准方法(Western blotting 或免疫荧光染色法)测定交联率.
1.如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在,会标记反应.因此,蛋白质在反应前要对0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5 mol/L硼酸缓冲液充分透析;
2.所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同,选择不当则影响标记的效率,应先用几个不同的比来筛选最适条件;
4.由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此时可加入去污剂如Triton X-100,Tween 20等.
5.当游离ε-氨基(赖氨酸残基的氨基)存在于抗体的抗原结合位点时,或位于酶的催化位点时,生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性.此时,应试用其它交联方法;
6.生物素还可能与不同的功能基团,如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基,也可与糖基共价结合;
8.在细胞的荧光标记实验中,中和亲和素的本底低,但由于链霉亲和素含有少量正电荷,故对某些细胞可导致高本底.
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