骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长,如附着性生长的细胞多时,用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来.通常要维持细胞于指数生长期(细胞培养时间为15~20小时),每3~5天取细胞0.2~1ml移入到10ml新培养液中,其最大细胞密度不能超过5×105~106/ml.一般使用含有高糖的DMEM培养液,并补加有pH的稳定剂HEPES.
4、在脾中部切开一小口,用注射器芯从一端轻轻压挤,再用无血清培养液冲洗,令细胞通过纱网,收集入平皿中,或用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液,反复抽吸数次方法获取细胞,再制成细胞悬液亦可.
6、离心,去上清,用含血清培养基调节细胞浓度为2×105/ml,接种入培养板中,24孔板每孔加0.1ml.
2、滴加1M NaOH溶液并不断摇动,直至完全溶解,再滴加等量1M HCl溶液,恢复pH在7.0左右.
4、0.22微米滤膜滤过除菌,分装,-20℃冰箱贮存.使用时,每100ml培养液(含血清)加1ml HT贮备液和1ml A贮备液.
4、配40%浓度时,用刻度吸管吸0.4ml PEG和0.6ml无血清培养液混合、37℃水中温育备用.
1、将1ml 40%的PEG液一滴滴加入到细胞团中,在60秒内加完,同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管.
6、用2倍HAT培养液培养悬浮细胞,取24孔板,每孔中加0.5ml,另96孔板每孔中加0.1ml.
7、5%CO2温箱,37℃,一周后第一次更换培养液,培养板中预先接种有饲养细胞,加2×HAT选择培养液与原等量培养液混合后,即成为1×的HAT培养基.
5、另取杂交瘤细胞悬液和0.5%琼脂等体积混合(0.25%琼脂),加2ml到预先铺有底层琼脂的瓶皿内.
7、10~15天后,有细胞集落形成,适时移入24孔培养板中扩大培养.如用琼脂糖,底层浓度为0.6%,上层为0.3%琼脂.
6、适时检测每孔培养上清,挑选呈阳性培养孔的细胞继续进行有限稀释,直至确信孔中细胞为单克隆为止.
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