摘要：介绍常规石蜡切片的制备,苏木精-伊红染色方法,组织化学及免疫组织化学染色方法,如：PAS染色,Mallory三色染色法,Van Gieson苦味酸酸性复红法,网状纤维染色-Wider染色法,苏丹Ⅲ(Ⅳ)染色方法等等.
(1)取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪,切取组织块时,从刀的根部开始向后拉动切开组织.组织块的厚度约为0.2~0.3cm,大小为1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜.取好的组织块用10%福尔马林溶液固定24~48h.
(2)包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明,然后入溶融的石蜡中浸透每次30min,共3次;再包埋.
(4)苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5~20min,染细胞核.自来水冲洗3~5min.
(一)组织化学(histochemistry)：一般称为特殊染色,基本原理是通过应用某些能与组织细胞化学成分性结合的显色试剂,定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有的形态学改变,对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值.通过光镜或电镜观察,可以检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等.
1.过碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS染色)：过碘酸是一种氧化剂,它能氧化糖类及有关物质中的1.2乙二醇基使之变为二醛,醛与Schiff氏试剂结合,形成红色的取代色素而得到定位.PAS染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉菌及寄生虫等物质.是广泛应用的染色方法.在肾小球肾炎时PAS染色可显示基底膜和系膜区的改变.
一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言,其结构特点是细胞间质内基质外含有较多的纤维成分,主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维,我们仅简述这三种纤维的常见染色方法.
(1)Mallory三色染色法：常用于判定多种组织、器官的病变程度及修复情况,区分肿瘤组织中的纤维成分与平滑肌.
(2)Van Gieson苦味酸酸性复红法：可以显示组织、器官的损伤、修复及硬化情况,特别是用于鉴别肿瘤组织中的胶原纤维与平滑肌纤维,可为诊断提供重要依据.
(3)网状纤维染色-Wider染色法：可以用来显示病变组织网状支架的情况.特别是在肿瘤病理诊断中,网状纤维染色对于鉴别来源于上皮组织和间叶组织的恶性肿瘤具有重要价值.
3.脂肪的染色方法：脂肪染色常用脂溶性色素,如苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O等.这类染料既能溶于有机溶剂如乙醇、丙酮内,又能溶于脂肪内.由于该类染料在脂质中溶解度较大,染色时染料便从染液中转移到被染的脂质中去,使脂质呈染液的颜色.主要用于显示组织脏器的脂肪变性和类脂质的异常沉着.
(二)免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)：是指应用免疫学和传统的组织化学的原理,利用抗原抗体性结合反应对组织、细胞中的特定抗原(或抗体)进行定位和定性的一种染色技术.具有较高的性和性,其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来,直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽类物质的存在,并可精确到亚细胞结构水平,利用计算机图像分析系统或激光共聚焦显微镜技术等可对被检物质进行定量分析.标记物为荧光、酶、免疫金银及铁标记技术等.
IHC可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药基因蛋白表达检测,以及细胞周期和信号传导的研究等.
(4)5%~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10min.倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体,37℃孵育1h或4℃过夜.
(6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)或滴加生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30min.
(8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)或辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30min.
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