摘要：用ELISA量测定大鼠血清、血浆或其它相关液体中TNF-B含量,介绍实验原理,试剂配制,操作步骤,注意事项等.
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中TNF-B水平.用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入TNF-B、生物素化的抗TNF-B抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色.TMB在过氧化物酶的催化下成蓝色,并在酸的作用下成最终的.颜色的深浅和样品中的TNF-B呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度.
如配制5 ng/mL标准品：取0.5ml 10 ng/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推.
6. 检测溶液A：1&time120ul/瓶(1：100)临用前以检测稀释液A 1：100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml.如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制.
1.血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔.除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37℃反应120分钟.
5. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟(此时可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显).
6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转).用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值).
1.每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4.测量时先用此孔调OD值至零.
吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次.
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度.
3.请每次测定的同时做标准曲线.如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数.
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