摘要：端粒是真核生物染色体末端的DNA-蛋白结构,这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法.
端粒是真核生物染色体末端的DNA-蛋白结构,端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列,这一序列在生物进化中有高度的保守性(人重复序列为TTAGGG).已确认端粒在基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合(如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失)中起重要作用.
由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端,多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短.这一现象在体内和体外都得到,并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关.
这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用.与体细胞相对照,生殖细胞是性的,它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息.因此它必须对抗端粒缩短.这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成.
端粒酶是一种核糖核蛋白,它们用自身的RNA成份的互补序列作模板,催化TTAGGG重复序列加到染色体末端.在大多数性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达.端粒酶反应超越了细胞的增殖,这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件.
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性.由于需要大量的样品材料,且检验灵敏度受局限,这一方法已被端粒重复扩增法(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代.
标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物,使用放射性标记,经凝胶电泳后,通过放射自显影显示结果.
这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法:活性光密度酶联免疫测定法.这种方法具有如下特点:
本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基础上的,它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR扩增,并与后序的ELISA法结合在一起.本法可分如下几步:
第一步:端粒酶将端粒重复序列(TTAGGG)加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端.
第二步:利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物,产生出的PCR产物带有的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物.
PCR产物变性后与Dig标记的端粒的重复检测探针杂交.终产物可经生物素标记的探针固定到亲和素包被的微量滴定板上.固定的PCR产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛复合物(anti-Dig-POD)检出.最后,经过分解底物TMB形成一种有色的反应物,再用酶标仪进行检测.
—若准备细胞提取物,将细胞小团在200μl裂解试剂中重悬,冰上预冷并提吸至少3次,冰中孵育30分钟.如果将冷冻细胞团用于提取,加入裂解液前在冰上融化细胞团.
—小心移去上清液并移入新的离心管中.将细胞残渣带入,我们推荐仅抽吸175μl细胞提取物.
—如不立即进行TRAP反应,将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻,将提取物储存在-80℃.
—测定端粒酶活性的组织标本准备,需要小心的采样并保存临床材料,因为肿瘤细胞的污染可产生正常组织中的假阳性信号,而由于不恰当的保存也可在肿瘤样本中产生阴性信号.如不是立即用于端粒酶PCR ELISA组织样本应以小片在液氮中休克性冷冻,并保存在-80℃.
—小心将上清液移入新的离心管中,确保无组织残片被带入,我们仅抽提175μl组织提取物,以标准方法测定蛋白浓度,在液氮中休克性冷冻小份组织提取物,将提取物存放在-80℃.
—对于每一待例检测样本,先将25μl反应复合物加入适合PCR扩增的管中,加入1-3μl细胞提取物(相当于1*103-3*103细胞或1-50μg总蛋白).并加入无菌水至总体积50μl,所有吸取步骤在冰上进行.
—每个样品取20μl变性试剂加入适宜的离心管中,若有大量样本,使用无核酸酶包被的微孔板MTP.
—取出100μl混合物加入试剂盒中已包被的微孔板的每个孔中,并用盖子盖住小孔以防蒸发.
—弃去全部杂交液,以清洗缓冲液洗三次,每孔250μl每次至少30秒,小心弃去冲洗液.
—完全弃去溶液,以每孔250μl清洗缓冲液冲洗5次,每次至少30秒,小心弃去冲洗缓冲液.
将细胞提取物与无DNA酶的RNA酶预孵育,降解端粒酶内源性RNA作为检测端粒酶的阴性对照,另一种方法为热处理以取得阴性对照.用RNA酶处理标本,阴性对照最大的吸收值为0.25A450nm-690nm,如果数值较高,整个实验包括TRAP反应需重新进行.
阳性对照的吸收值在底物反应20分钟后检测,应高于1.5(A450nm-A690nm),相当于使用1*103细胞进行检测.如果数值较低,整个实验包括TRAP反应需重新进行.
将样本的吸收值减去阴性对照的值.如果吸收值的差异(ΔA)高于0.2(A450nm-A690nm)可认为端粒酶阳性.
Ø 引物延长、扩增所用的水含有核酸酶.必须使用无核酸酶的重蒸水(DEPC或Velcorin处理)来制备试剂.
Ø 试剂受核酸酶污染.另换阳性对照细胞提取物及样本重复全部检测.仔细检查是否污染了DNA酶及RNA酶.
Ø 抗DIG-POD工作液失效,必须使用新准备的抗DIG-POD工作液,检查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并准备新鲜的工作液.
Ø 阴性对照、裂解试剂、或反应混合物被端粒酶阳性细胞提取物污染,以RNA酶处理或65℃热处理10分钟是阴性对照失活.重复包括扩增在内的整个实验.
Ø 阴性对照、裂解试剂、反应复合物、或其它试剂可能被以前实验的扩增产物所污染.
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