因为免疫沉淀的目的主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白,所以实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相互作用的效果.其主要受抗体的结合能力,目的蛋白和抗体的可接触性两个因素影响.所以免疫沉淀实验中的关键因素是抗体的选择以及裂解缓冲液中的配方.对于前者而言,抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面,对抗体结合力的要求和免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多;对于后者而言,主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在不目的蛋白天然构象的情况下(不影响目的蛋白和抗体的相互作用效果)将目的蛋白从细胞局部定位(比如位于某些细胞器中)中有效出来.
免疫共沉淀的目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物,最终检测目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用.所以实验中要注意的关键点和免疫沉淀相比,除了要注意抗体和目的蛋白相互作用的效果外,还要注意目的蛋白复合物的完整性.后者主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在有效目的蛋白复合物进入可溶相的情况下不目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用.所以,免疫共沉淀实验中的关键因素除了抗体的选择外,裂解缓冲液配方中的去垢剂的成分和浓度对免疫共沉淀实验的成功与否至关重要,其选择相比免疫沉淀实验而言,要求更严格.
染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目的蛋白有相互作用的DNA片段,最终检测目的蛋白和DNA片段的相互作用.因此,实验中要注意的关键点和前二者(免疫沉淀和免疫共沉淀)有所不同.因为在实验中中蛋白质-DNA复合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用,所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过程中.因此,除了后续的基本操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些许不同,有额外需要注意的是向外,其对抗体的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多,相对而言,裂解缓冲液的成份并不是关键因素.
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