染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法.这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定会出现何种组蛋白修饰.ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来.
1. 准备好一盘细胞量达到1 x 106的培养皿(注意:培养细胞时要适当处理细胞使得目的基因处于被的状态)
2. 于培养基中加入适量的甲醛,使甲醛终浓度达到1%,37℃下交联10分钟.(注意:交联的时间太短或太长都会影响最终的结果)
5. 去掉上清液,加入200微升裂解液(注意:每1 x 106个细胞加200微升裂解液),冰上裂解10分钟;
第二步:用超声波的方法把DNA破碎成合适的大小(250bp至800bp),因为在第一步中用甲醛交联了细胞内的大,所以结合蛋白质的DNA片段相对没那么容易被打断.
6. 用超声波破碎细胞裂解液中的DNA至DNA的长度为250bp至800bp(注意:整个操作过程必须在冰上进行,破碎中途不断的跑胶检测DNA长度是否达到250bp至800bp)
第三步:用性抗体与DAN结合蛋白结合,用免疫沉淀的方法法分离出复合体.纯化出复合体中的小片段DNA
7. 把破碎好的细胞裂解液置于冰冻离心机中4°C 13000 rpm 离心10分钟,再把上清转移到2ml的离心管中;
8. 用CHIP稀释液把细胞裂解液稀释10倍,并将此液称为原液(注意:稀释后取出200微升原液作为Input样品);
9. 为了更好的去掉结果背景,往原液中加入75微升的蛋白A/G琼脂糖珠,4°C孵育30分钟,再稍微离心一下,收集上清液(以下称为A液);
10. 把A液分为两份,一份加入结合目的基因的蛋白的抗体,一份加入Flag标签抗体,4°C孵育过夜;
11. 分别加入40微升的蛋白A/G琼脂糖,4°C摇晃孵育1小时;(注意:孵育的时间不能太长,而且摇晃的速度要快)
12. 700 至1000 rpm 4°C冰冻离心1分钟,去掉上清,反复清洗琼脂糖珠四次(注意:务必把上清液彻底的去掉,否则残留的上清液会造成假阳性);
16. 纯化过的B液可以进行PCR分析(注意:检测时要带上之前取出的部分原液作为Input对照);
注意:12步以后的结果可以加入25微升3 x上样缓冲液,沸水变性5分钟,离心取上清做Western Blot检测.
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