摘要：1952年噬菌体空斑技术应用于动物病毒学,从而使病毒蚀斑技术成为许多病毒的滴定和研究方法.
1952年,Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学,从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法.
病毒感染细胞后,由于固体介质的,的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展.经过几个增殖周期,便形成一个局限性病变细胞区,此即病毒蚀斑.从理论上讲,一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的,因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆.但在实际操作中,常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况,影响滴定的准确性和克隆的纯一性,为此,接种的病毒液要充分分散和稀释.对于细胞结合性病毒,如MDV,需用单层细胞;对细胞性病毒,即可用固相介质悬浮的细胞,也可用单层细胞,但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上,以防的病毒在液体介质中流动.固体介质的浓度由病毒的大小而定,大病毒用浓度较低的介质,小病毒用浓度较高的介质,以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内.小蚀斑需用显微镜观察,1-10mm的大蚀斑可用计数.为便于观察,常用中性红等染料染色.因病变细胞不吸收中性红,病变细胞区便呈现无色蚀斑.病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示.例如,3个细胞瓶的平均蚀斑是58,接种量为0.2ml,病毒的稀释度为2.5×103,则病毒原液的滴度为:58÷0.2×2.5×103=7.25×105(PFU/ml)
蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定,也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性.
(1)病毒生物学纯化(Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降,因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒.这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致.这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称“克隆株”.克隆后的病毒经在细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验.为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒.同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个,挑取在其附近10mm 都是健康细胞的蚀斑.挑取后的病毒应传两代或两代以上.一般认为,中性红染料会由于“光敏”作用而病毒蚀斑的形成和宿主细胞.因此,加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养.
(2)蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种性较高的方法,试验以使蚀斑数减少 50%的血清稀释度作为其中的效价.试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价.其操作原理与传统的血清中和试验大致相同.
由于本试验的操作比较繁锁,目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种都接受的诊断方法,仅在OIE国际动物卫生(第六版)中列为对裂谷热的诊断方法之一.
最新评论