摘要：氯金酸在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液.由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金.
氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液.由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金.
胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合.胶体金对蛋白质有很强的吸附功能,蛋白质等高被吸附到胶体金颗粒表面,无共价键形成,标记后大物质活性不发生改变.
金颗粒具有高电子密度的特性.金标蛋白在相应的配体处大量聚集时,在显微镜下可见黑褐色颗粒或可见红色或粉红色斑点.
免疫金银染色:利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理,通过银颗粒的沉积,在光镜下可见抗原抗体反应的阳性部位呈现银的黑褐色.
取0.01%氯金酸水溶液100ml加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液0.7ml,金的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色,继续煮沸15分钟,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm,A1cm/535=1.12.
5、将沉淀悬浮于一定的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜,置4℃保存.
直径为3～15nm胶体金均可用作电镜水平的标记物.最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记.
胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究,主要包括:①、细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察.②、单层培养中细胞内抗原的检测.③、组织切片中抗原的检测.
应用胶体金标记的抗体,分析细胞表面抗原.胶体金可以明显地改变红激光散射角,区分不同的标记,能同时进行几种标记.
单分散的免疫金溶胶清澈透明.与相应抗原或抗体发生性反应后出现凝聚,溶胶颗粒增大、沉降,光散射随之发生变化,溶液的颜色发生变化.
用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离,得到的区带转移至硝酸纤维素膜,与性的抗体保温后,再与胶体金标记物温育,根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的性抗原.
有4个组分:⑴、吸水纸(加样区).⑵、玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥的金标抗体(流动带).⑶、硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带).⑷、吸水纸.以上各组份首尾互相衔接.
硝酸纤维素膜的活化:先使硝酸纤维素膜上形成氨基手臂,然后再加入戊二醛在手臂上形成醛基,多肽与活化膜的活性基团共价联接.
④、可流动性.标记或非标记受体以干态吸附于流动带,在流动带加入高效助溶剂,从而使受体具有快速溶解的特性.
吗啡是鸦片类镇痛药,中枢神经系统.是可待因和的主要代谢物质,吗啡不经代谢即可排泄.
测定原理:吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区.通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体,最小检出量300ng/ml.
阳性(+):吗啡300ng/ml以上,质控区出现一条紫红色条带,测试区内不出现紫红色条带.吗啡浓度高于300ng/ml时,胶体金抗体与吗啡全部结合,从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带.阴性(-):吗啡在300ng/ml以下.出现两条紫红色条带,一条在测试区内,另一条在质控区内.吗啡浓度低于300ng/ml时,胶体金抗体不能与吗啡全部结合.这样,胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合,测试区内会出现一条紫红色条带.无效:质控区未出现紫红色条带,表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏.
甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌的肿瘤标示物,对肝癌的早期诊断、早期治疗具有重要临床意义.AFP单抗A、B,羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上,金标AFP单抗C固定于玻璃纤维素膜上.阴性1条带,阳性2条带, 3条带为强阳性,不出现有色条带为试剂失效.
胶体金标记的抗人IgG,样品中的梅毒抗体与胶体金标记的抗人IgG结合,沿硝酸纤维素膜移动,在包被有基因重组的梅毒螺旋体抗原结合,出现红色反应线.
渗滤装置为一充满吸水垫料的塑料小盒,在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜,膜上预包被抗原或抗体斑点.
捕获法:在固相载体上包被二抗→样品(待测抗体)→抗原→金标单抗.
1、相同点:检测原理相同.以微孔滤膜为载体,滤膜的毛细管作用促进抗原抗体结合反应,通过胶体金结合物达到检测目的.
金免疫层析分析为狭长形膜,由4部分组成,依次是吸水纸、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸.金免疫渗滤分析为圆形硝酸纤维素膜及底层的吸水垫料.
金免疫层析分析是通过层析作用的横向流动,金免疫渗滤分析是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行.
1、进一步提高检测灵敏度.采用信号放大系统如生物素亲和素系统或免疫金银染色法,并结合一些相应的简单检测仪器.
(2) 控制受体捕获量:固定多种不同量的受体,在膜上包被多条反应线,观察各自显况,将待测物含量确定于某一浓度区间.
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