细胞凋亡的检测方法众多,流式细胞仪检测凋亡,是常用的方法.由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数.因此,具有其它方法无可比拟的优越性.下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用.
下面是一幅凋亡过程图.在凋亡剂的作用下,首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体,线粒体的功能发生衰退;后是caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,这时细胞的形态已经发生了改变,可以看到细胞变小,胞核皱缩;最后是细胞内DNA断裂,形成凋亡小体.
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒(产品编号为BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒.其检测主要采用阳离子型荧光染料.
原理是:正常细胞中,染料可以在线粒体内聚集,发出明亮的红色荧光;而细胞凋亡后,其线粒体膜电位发生改变,染料无法进入线粒体,只能在胞质中以单体形式存在,发出绿色的荧光.可以在荧光显微镜下,或流式检测.采用488nm激发,其检测波长分别是527nm和590nm.整个实验过程操作简单,只需要30min就可以见到结果.
Caspase家族可以检测的非常多,也有不少商业的试剂盒可以应用.即使没有相应的试剂盒,只要有相应抗体基本上是可以检测的,具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤.
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变,细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种.在凋亡细胞中,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧.Annexin-V是一种35-36KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白,它对PS具有较高的亲和力.细胞凋亡时,可以和外翻的PS 结合,从而可以检测凋亡的细胞.发亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻,因而也会阳性.因此,常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外,还会加一种DNA染料,常用的有PI和7-AAD,由于死亡的细胞膜通透性增高,染料可以进入细胞内和DNA结合,从而可以发荧光,区分出死细胞.
下图给出的是在使用FAS单抗前后的检测结果,横坐标是Annexin-V FITC,纵坐标是PI,左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞,左下象限是存活的细胞,右下象限是凋亡的细胞.
在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时,要特别强调一点:该方法适用于悬浮生长的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测.对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,从而影响检测结果.尽管目前,包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞.我不推荐用该方法检测.因为其重复性较差,且需要操作时非常小心.
DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期,即细胞增殖状况的.利用细胞内DNA能够和荧光染料,如PI结合的特性.细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同,流式检测的荧光轻度也不一样.G2-M期DNA含量是G0-G1的两倍,而S期介于两者之间.但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少,因而可以在细胞G0-G1期前面有一个亚二倍体峰,从而认为是凋亡细胞.但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的,因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞.在90年代,该方法曾经风靡一时,现在看来,那时的实验结果需要推敲.尽管,经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0-G1期峰的一个峰,死亡的细胞峰离G0-G1期峰较远,但是这种典型的结果似乎很难获得.有其它的替代方法,完全可以不用这种方法.
晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂,因而可以出现DNA ladder,从而也就有了经典的检测方法TUNEl.流式也能进行Tunel检测,其检测原理与经典Tunel原理基本一致.以BD公司的为例,其利用 TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端,从而使凋亡的细胞具有荧光.但是由于在细胞内标记,细胞需要进行固定处理,操作类似免疫组织化,容易造成假阳性.采用原装大厂的试剂盒,并且严格的设立对照.经过预实验方法稳定后再进行大规模实验.标本处理后,均可以用荧光纤维镜进行观察,拍照.流式检测后,可以进行精确的计算凋亡百分比.这一点,经典TUNEl是做不到的.
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