摘要：免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原(或抗体)的新技术.免疫酶法的基本原理与免疫荧光法有所相似.
免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原(或抗体)的新技术,是在免疫荧光法的基础上发展起来的.免疫酶法的基本原理与免疫荧光法有所相似,免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上,制成酶标抗体,再借助酶对底物的催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位.已如前述,免疫荧光法具有操作简便、灵敏、性高、省时的优势,但同时也具有令人遗憾的不足,特别是荧光标 本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题.为此,Nakane等人(1966)尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法,从而成功地开创了酶标记抗体的新技术(酶标抗体法).Sternbenger等人又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引人,使免疫酶法有了很大的进步,成为当今使用最为广泛的免疫组织化学技术.
免疫酶法与免疫荧光法相比较,具有以下优点:酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察,而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察(免疫电镜技术),光镜与电镜的结合,使灵敏度进一步提高,标本又能长期保存,并能加设HE染色等其他复染,有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来(定性与定位),弥补了免疫荧光法的不足.
从理论上讲,用细胞化学方法能显示的酶,均可用于标记抗体进行免疫酶法染色,但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多.sternbenger等人指出:用于标记的酶应具备以下六点:
1)酶催化的底物必需是的,而且容易被显示,即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察.
2)酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定,即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散,而影响组织学定位.
上述六点中以1.2两点最为重要,因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物.符合上述要求的,最为常用的酶是辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,H::flJ).其次是碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP),除此两种外,还有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)等,但因其形成的不溶性色素扩散作用较大,在应用上受到很大.
HRP广泛分布于植物界,因其辣根含量最高而得名.它是由无色酶蛋白和深棕色的铁叶结合组成的一种糖蛋白(糖占18%左右),量为40000道尔顿, 等电点3~9,最适 PH为 5.0左右.HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铰溶液,其活性部分为铁叶琳,称辅基.酶的蛋白部分无活性.酶蛋白和铁叶琳辅基的最大吸收光谱分别为 275urn和403urn;HRP的纯度用两者的光密度比值(M03人工卫75)来衡量,以RZ(Reinheitzahi)来表示.一般认为,标记酶 的RZ值为 3.0左右,不应<2.8,RZ值越小,酶的纯度越差,对于纯度低,质量差的酶,需经纯化后才能使用.
AKP是一种磷酸酶的水解酶,磷酸单酯酶对于连接于作用物磷酸基上的醇基没有性,因它可以水解多种有机磷酸酯,生成醇和磷酸盐离子.该酶在许多 人体组织或动物组织中有分布,如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等.AKP的量为80KD,最适PH为9.8,其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等 因素影响,如用二乙醇胺缓冲液(1mol/L,PH9.8)对AICI’具有活化作用,酶的活性高,而用甘氨酸一NaOH缓冲液则对AKP有作用. AKP的活化剂有镁和锰离子,Mg++的适应浓度为10mol/L.甘氨酸、柠檬酸盐,EDTA等对 AKP有作用.AKP对温度具有较高的性,从 25℃增加到 35℃,其催化反应速度增加1.5倍.当选用不同的底物时,AKP可催化形成不同颜色的终产物.例如,萘酚一AS一MX和快蓝(Fast blue,Fh)为底物时生成蓝色产物,可与HRP催化的产物形成鲜明的对比,用快红(Fast red)代替快蓝则生成红色不溶性产物,而且内源性AKP较易清除,可以较好地避免内源性酶的干扰,使其具备了某些独特的优点而日益备受重视.
GOD所催化的底物为葡萄糖,电子供体为对硝基蓝四隆(Paranitroblue Tetrazolium),终产物比较稳定,为不溶性的蓝色沉淀.从理论上讲,GOD较AKP和HRP为佳,因为哺乳动物组织内不存在内源性葡萄糖氧化 酶,这样可以很好地避免内源性酶的干扰.但是,GOD的较HRP大三倍,具有较多的氨基,在标记时易形成广泛的聚合,而影响酶的活性.
用酶标记的性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合,再与酶的底物作用产生有色的产物,沉积在抗原抗体反应的部位,即可对抗原进行定性、定位以至定量研究.
直接法的第一步是的——即酶催化底物的反应,其余步骤则的,可用各种电子供体介导.以HRP为例,HRP的底物是巴H2O2,在分解已 过程中,与H2O2形成初级复合物,无电子供体存在时,反应不再继续进行,当电子供体存在时,反应以一定的速度形成第二种复合物,继之HRP催化H2O2 所形成的中间型产物,迅速生成水,酶被还原,电子供氢体被氧化,聚合,再经氧化环化,最后形成引哚胺多聚体,于酶反应部位,形成不溶性棕褐色沉淀,与组织 对比清晰,达到定位、定性、定量的目的.
直接法简便、快速、性强,非性背景反应低.其缺点是,每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物,且性较间接法低.
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