摘要：MP具有促进血液凝固反应发生与血栓形成等多种重要生物学活性.越来越多的研究提示,检测血液MP水平与性质有助于监测病情、指导治疗与疗效判断.
各种血液细胞及血管内皮细胞受到刺激而活化或发生凋亡后,细胞膜磷脂酰丝氨酸由胞膜内层进入外层,以出芽方式形成小泡状结构而脱落,形成所谓的“微粒(microparticle,MP)”.正体血液中即存在少量MP,而在许多疾病中MP水平明显升高.MP具有促进血液凝固反应发生与血栓形成等多种重要生物学活性.越来越多的研究提示,检测血液MP水平与性质有助于监测病情、指导治疗与疗效判断.
MP膜上表达与其来源细胞相同的表面标志,选取针对性标记的单抗,它可确定其细胞来源;MP体积远小于其来源细胞,流式细胞术检测中的前向散射光强度可反映颗粒大小;MP外露的磷脂酰丝氨酸可应用荧光标记AnnexinV显示,这些都为应用FCM检测MP提供了基础.
对细胞表面标志的确认与单克隆抗体制备技术的发展及完善,使FCM成为当今定量与定性检测MP最为广泛的方法.检测不同细胞来源的MP所使用的单抗如下:血小板微粒(platelet micorparticles,PMP)使用抗糖蛋白抗体,比如抗CD41、抗CD61与抗CIM2a等抗体;检测内皮细胞微粒(endothelial microparticles,EMP)使用的抗体包括抗CD31、抗CD51与抗CD144等抗体;检测单核细胞微粒(monocyte.derived microparticles,MDMP)使用的抗体包括抗CD14抗体;检测淋巴细胞微粒使用的抗体包括抗CD3、抗CD4与抗CD19等抗体.可见检测某种细胞来源的MP可有多种抗体供选择,而应用不同抗体检测结果不尽相同,比如应用抗CD41a抗体检测出的PMP水平高于抗CD61和抗CD42a抗体检测出的水平¨ ;应用抗CD31抗体检测冠心病患者EMP水平较正常对照升高10倍,而抗黏附抗体检测EMP仅增高1.5—2.0倍,这可能是由于不同抗体检测灵敏度不同所致.除表达来源细胞表面标志外,MP可表达某些来源细胞原来并不表达的蛋白,使MP获得新的生物学活性,比如PMP表达组织因子(tissue factor,TF),而在巨核细胞并未检测到此,TF使得PMP获得促凝活性,在许多疾病中发挥致病作用.
由于多步骤操作易导致细胞体外激活,尤其是血小板,从而影响检测准确性,因此,检测者除了要注意选择抗体之外,对FCM的具体操作也应作进一步改善,以提高准确性与灵敏度.比如在样本收集方面,有研究使用柠檬酸.茶碱.腺苷酸.双嘧达莫抗凝管,与枸橼酸钠抗凝相比,能更有效血小板体外激活,了结果的可靠性¨;由于MP很小,有可能不能通过前向散射光强度来反映(能检测最小颗粒直径不小于0.1 p.m),此外MP表面积小导致标记的荧光强度小,使得荧光检测灵敏度与准确性降低,改良方法中使用已知直径的微球来校正流式细胞仪,从而提高准确性;应用3.0 m与0.8m乳胶微粒作为内参照检测PMP,0.8m乳胶微粒用于设门,3.0m乳胶微粒用于定量,此方法有效排除血小板的干扰,也有效地提高了准确性.
ELISA方法也可用于检测MP,但远不及FCM广泛.Osumi等选用多种抗血小板抗体以期建立检测PMP更优良的ELISA方法.结果发现以抗 CD42a抗体作为捕获PMP的一抗,抗CD42b抗体作为二抗,可获得阳性率与性最高的检测结果,该方法与FCM检测结果具有一致性,提示应用 ELISA检测MP的可行性.也有人先利用AnnexinV捕获血液中的MP,之后应用性抗体以确定MP的细胞来源,同样获得了有意义的研究结果.
血小板活化聚集、血栓形成以及血管内皮损伤参与冠心病(coronary artery disease,CAD)的发生,这些病理变化均导致MP的生成;而随后发生的缺血缺氧与炎症刺激,进一步促进MP的产生.研究发现血液中EMP水平与 CAD各临床亚型,包括心肌梗死(myocardial infarction,MI)、不稳定性心绞痛(unstable angina,UA)与稳定性心绞痛(stable angina,SA),存在如下的相关性:FCM检测结果显示,EMP在各亚型都显著升高;3种亚型中CD31(+)EMP水平高低顺序为:MI>UA>SA,而CD51(+)EMP无此规律;MI首发患者CD31(+)EMP显著高于MI复发者.由此可见,EMP水平,尤其是CD31(+)EMP水平,可提示冠脉缺血缺氧与炎症反应的严重程度,是反映CAD中内皮损伤的有用指标.冠心病术后治疗也导致血液中MP水平和性质的变化.经皮冠状动脉支架植入术后易发生血栓形成与血管再狭窄,此时PMP水平较术前升高,给予抗血小板糖蛋白gP II b/lUa药物治疗能有效预防血栓形成,同时也了PMP的生成;主动脉.冠状动脉旁移植手术后患者外周血液中TF(+)PMP水平高于正常者,促凝活性也明显增强.PMP可促进凝血反应与血栓形成,血液中PMP水平提示血栓形成的活动性,因此,治疗中检测PMP水平有助于监测病情与观察疗效.
研究发现血液中EMP与PMP水平可提示高血压患者血管内皮细胞损伤与血小板活化水平.未经治疗的高血压患者EMP水平明显升高,升高幅度与血压高低明显正相关.在同时伴有吸烟、糖尿病等其他导致内皮细胞损伤的因素的情况下,高血压患者EMP水平升高程度则更为明显,并仍与血压水平呈正相关;而与之相比,其他内皮细胞损伤的标志物可溶性VCAM-1与ICAM-1水平升高程度则与血压水平不呈现相关性,因此,血液中EMP水平可作为反映血压升高而导致内皮细胞损伤的性标志物.此外研究还发现PMP仅在恶性高血压患者明显升高,与血压水平正相关,而在缓和性高血压患者无升高.
患者血液中MDMP水平升高,伴有肾、神经或视网膜并发症的患者MDMP水平又高于无并发症者,尤其有神经并发症患者MDMP水平升高更为明显.与此同时,血液中PMP水平明显升高,提示血小板的活化,并与MDMP水平有相关性.Ⅱ型糖尿病患者常伴有高血脂症.研究发现,在Ⅱ型糖尿病高血脂症患者中,具有促凝活性的TF(+)PMP与MDMP水平高于正常对照,而TF(+)MP水平与患者体重指数(body mass index,BMI)及血浆低密度脂蛋白水平有相关性.
妊娠本身是一种高凝状态,某些妊娠并发症的发生可能与促凝变化有关.正常妊娠者MP水平即明显升高,而发生反复自然流产者的血液中EMP水平高于正常对照,提示存在血管内膜损伤,而导致血栓形成.先兆子痫的发生可能与血管内膜功能异常有关.与正常对照者相比,先兆子痫患者血浆可于体外刺激内皮细胞更高水平EMP的产生;血液中CD31(+)与CD62(+)EMP水平也高于正常对照者水平,并且与病情严重程度和24 h蛋白尿水平有正相关性.因此,检测EMP有助于判断先兆子痫¨.
抗磷脂综合征(anti-phospholipid syndrome,APS)是由抗磷脂抗体引起的一组临床征象的总称,主要表现为血栓形成、血小板减少、习惯性流产等.研究发现APS患者血浆EMP水平增高,具有较强的促凝活性,体外实验显示APS患者血浆可于体外EMP的生成.因此内皮细胞是抗磷脂抗体的目标之一,导致其活化或损伤,促进促凝 EMP,从而形成获得性的高凝状态¨.在许多其他疾病中也存在MP的变化,比如早已发现在免疫性血小板减少性紫癜患者血液中,PMP水平升高,与自身抗体导致血小板相关;阵发性睡眠性血红蛋白尿患者可发生血栓形成,而血液中促凝PMP生成增加L1;多发性硬化急性发作期患者血液中 CD31(+)EMP水平升高,而在缓解期CD51(+)EMP水平升高,两者可分别作为多发性硬化内皮细胞急慢性损伤的标志物¨.
(1)血小板、单核细胞与血管内皮细胞活化或损伤是许多疾病的病理机制或者是其导致的病理结果,作为细胞活化与损伤的产物,MP能更加直接而地反映其来源细胞的功能状态,也为疾病的发病机制或提示病情发展提供依据.
(3)MP为疾病鉴别诊断也提供了有用的依据.目前,检测血液中微粒最主要的方法仍是流式细胞术,具有快速准确和易操作等优点,可提供精确的定量定性检测与质量控制,较其他方法更为可取.
最新评论