免疫组化：免疫组化检测NiV性抗原

　　在福尔马林固定的组织或细胞上进行操作免疫组化检测NiV性抗原是一种安全的NiV实验室检测技术.

　　很多组织都可以用来进行免疫组化来检测NiV的抗原.用纯化的NiV免疫兔而制备的兔抗血清和一些单克隆抗体进行免疫组化检测NiV性抗原.酶标第二抗体选用碱性磷酸酶标记的抗兔或者抗鼠的抗体.

　　①用福尔马林固定和石蜡包埋待测样品、阳性对照样品和阴性对照样品,并制作超薄切片放在载玻片上,每个样品至少制作2个玻片.然后进行脱腊：将这些载玻片放在二甲苯中浸泡3次,每次lmin;再将它们放在98%一100%乙醇中浸泡2次,之后用70%乙醇浸泡1次,再让自来水轻轻流过片子,以去掉的乙醇.

　　③将载玻片平放在一个湿盒上,用PBS洗涤5min.然后每个片子加200ttI.3%的H：O：,室温下作用20rain,阻断内源性过氧化物酶.用PBS洗涤5rain.

　　④在含有每个样品的一套片子上加200uL用含0.1%脱脂奶的PBS适量稀释的兔抗NiV的血清,再含有每个样品的另一套片子上加2001d-用含0.1%脱脂奶的PBS适量稀释的兔抗其他无关病原的血清,37℃作用1h.

　　⑤用PBS洗涤5rain,然后每个片子加上2～3滴EnvisionTM：溶液(过氧化物酶标记的抗兔的抗体,DAKO公司生产)+将载玻片平放在一个湿盒上,37℃作用20rain.

　　⑥用200uL二甲基甲酰胺溶解2mg 3-氨基-9-乙基咔唑(AEC),再加入到10ml0.02mol/L的乙酸溶液中(pH 7.0),然后加入5/lL H：02(30g/100m1),轻轻摇匀即为底物溶液.底物溶液用阳性对照的片子进行检测.作用2～5min使充分染色,再用蒸馏水洗涤.底物溶液应该在使用前临时配制.

　　⑦用苏木素对片子进行反向染色1-3min,然后用自来水冲洗,再加入Scott溶液(0.04mol/lNaHCOa,0.3mol/LMgSO+),然后用自来水仔细冲洗,再用蒸馏水冲洗,然后盖上盖玻片,里面加有水性封片剂.

　　⑧观察结果.阳性样品的细胞内中将看到棕红色颗粒沉积,它是病毒抗原存在的信号.细胞核是蓝色的,这便于观察组织细胞结构,并有助于识别病毒抗原在组织细胞中的.