在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大复合物，这叫作免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。
1. 1.5%琼脂的配制：pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2. 取干净的载玻片，平放于实验台(台面要水平)，将融化的琼脂趁热加在载玻片上(约加4mL)，使琼脂铺满整个玻片的表面。令其在室温下冷却凝固。
3. 将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器(内径2-3毫米)在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4. GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
5. 在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔血清，周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。
6. 在小塑料盒中铺一块滤纸，加少量水将滤纸浸湿，放两根牙签，将加好样的载玻片放在牙签上，盖好盒盖，放37℃温箱中过夜。
将载玻片从塑料盒中取出，在散射光的背景下(载玻片后方约15厘米处用手或深色物挡住)观察，或在特殊的装置上观察，在左侧的抗体孔与适当稀释的抗原孔之间可见白色的沉淀线，而右侧的对照则无。如果将载玻片放在紫光灯下观察，沉淀线会发出绿色荧光，这说明抗原-抗体复合物中含有GFP。
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