免疫细胞检测技术：用于免疫印迹的细胞裂解液的制备

　　摘要：大多数蛋白质溶液可与样品缓冲液混合并直接用于免疫印迹.下述方法可用于细胞去污剂裂解液,柱层析洗脱液和大多数其他来源的抗原样品.

　　大多数蛋白质溶液可与样品缓冲液混合并直接用于免疫印迹.下述方法可用于细胞去污剂裂解液,柱层析洗脱液和大多数其他来源的抗原样品.

　　直接分析蛋白质样品,需满足下列要求:①蛋白质样品必须溶于与凝胶电泳系统相匹配的溶液中.对于Tris/GlycineSDS—聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质溶液的pH值应接近中性,盐浓度应低于200mm01/L.否则必须用样品缓冲液进行大量稀释,且缓冲液中的其他成分对电泳没有影响.更换缓冲液的方法要适当,可通过透析或脱盐层析柱来更换缓冲液;②样品中的蛋白质浓度不能超过凝胶系统的上样容量.上述2个变量的参考值将在以后的凝胶电泳中详述.根据经验每个泳道总蛋白量不能超过150ug(每个小胶泳道<5ug).

　　免疫印迹从蛋白质溶液开始就需设置两组对照.对照包括含有待测抗原的阳性对照样品和能与阴性对照抗体发生反应的阴性对照样品.阳性对照是含有已知的或标准量的待测抗原的样品,来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或已鉴定的细胞系.它可提示免疫印迹是否成功,并能对抗原的相对量进行精确比较;如果阳性对照中抗原的量是已知的, 可粗略估计出待测样品中抗原的含量.阴性对照给出的是待测样品的背景读数.

　　若要比较多个样品,则需考虑蛋白质样品的标准化.例如,如果要比较不同细胞中的抗原水平,就需对细胞数或总蛋白进行标化.如果是测定不同浓度的纯化蛋白,则一般是标化总蛋白含量.然而对于柱层析分离的样品则需比较每一组分的总体积.样品中蛋白质的总量可用测定蛋白质浓度的常用方法进行测定.样品中若未加溴酚蓝,蛋白质较易定量.并可节省样品缓冲液.