摘要：克伦特罗属于beta兴奋剂,是一种高选择性的兴奋剂和激素,具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用.
克伦特罗(Clenbuterol)属于beta兴奋剂,是一种高选择性的兴奋剂和激素,具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用.进年来被一些人非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长.当用作生长调节剂时,其添加量是治疗量的5—10倍,常在动物体内残留而给消费者带来危害.
通常,HPLC或GC-MS是克伦特罗残留检测的确证方法,但是其前处理步骤费用昂贵,而ELISA快速检测试剂盒因成本低、操作简便、速度快、一次检测样本量大、仪器化低,现已成为常规的筛选方法.
测定的基础是抗原抗体反应.微孔板上包被有针对兔IgG(Clenbuterol抗体)的羊抗体,含有克伦特罗抗原的样品或标准品与酶标记物被加入到小孔中,经过孵育及洗涤步骤后,游离的抗原与抗原酶标记物竞争抗体结合位点,没有结合的抗原酶标记物在清洗步骤中被除去,将显色液加入到孔中并且孵育,结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物.加入反应停止液后使颜色由蓝色转为.在450nm处测量,吸光强度与样品的克伦特罗浓度成反比.
3)底物溶液:用柠檬酸缓冲液(1+9)稀释(注:柠檬酸缓冲液本试剂盒内有提供,稀释后的溶液避免光线mM 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0,简单混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜
8)分离全部上清液(应该是清亮的),使其升至室温(20-24℃),然后用C18柱纯化(见C18柱纯化步骤).
C18柱纯化方法: 所有试剂和样品处理必须在室温下(20-24℃)并严格控制过柱时的流速.(非常关键)
4)每孔内加入50ul酶联结合物,然后再加入100ul 克伦特罗抗体溶液(该反应速度快,使用多道移液器).
6)倾空微孔板,用250ul冲洗液重复洗板5次,最后,用力在吸水纸上将液滴拍干(洗板时,标准清洗液注满微孔,翻转微孔板倾空,尽量挤压微孔板,以防微孔板从框架上脱落).
7)显色:每孔加200 ul显色液,室温20-25℃避光孵育30分钟(显色液用1体积底物溶液+9体积柠檬酸缓冲液)8)孵育结束时,每孔加50ul反应终止液,充分混合,在450nm下读数.
1)样品中未知的Clenbuterol通过曲线)将得到的样品吸光度值减去所有空白值的平均值,计算标准液吸光值和样品吸光度值以及最大吸光度值
3)用样品或标准液吸光度值(B)除以最大吸光度值(B0)再乘以100,最大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率:
根据B/B0的值做出每一个标准样品的半对数曲线,相对应每一个样品的浓度就可从曲线.结果分析:
由于样品在反应中经过了预先稀释,因此根据标准曲线所得出的待测样浓度一定要再乘以其稀释因子才能得出其在样品中的正确含量.(尿液和血清的稀释因子是1,肝脏的稀释因子3,饲料的稀释因子是10,组织的稀释因子是50,牛奶和奶粉的稀释因子是50)
2)洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象,所以洗板排干后应立即进行下一步操作.
3)标准物质和显色液对光,最好避免直接在光线)混合要均匀,洗板要彻底(包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀).
6)不要使用过了有效期的试剂盒,也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样回引起灵敏度降低.
最新评论