摘要：单克隆抗体的生产既可采用动物体作为生物反应器进行生产,又可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产.
单克隆抗体的生产既可采用动物体作为生物反应器进行生产,又可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产,前者可通过诱发实体瘤及腹水瘤,从腹水中提取,也可采用牛淋巴液体外循环,从培养上清中提取McAb,后者在体外大量培养杂交瘤细胞,常采用旋转培养法,中空纤维培养法,悬浮搅拌培养法等.
美国Bio-Response公司使用牛淋巴液为杂交瘤细胞的培养基,每头牛都安装有抽取淋巴液的导管,含有营养物质和促进细胞生长的生长因子的淋巴液,经过滤系统,补充氨基酸、维生素、O2和CO2后,再流入中空纤维培养室,80%淋巴液送回牛体再循环,20%流入培养室,淋巴液营养物质,听过中空纤维的半透膜析出,供杂交瘤细胞生长,细胞所分泌的McAb通过微米极的多空半透膜流出培养室,每头牛可维持10个培养室,每天可生产5gMcAb,18头牛每年可生产2kgMcAb,中空纤维培养室中的细胞经分离后,可进行再培养已增加产量.
美国Damon Biotech公司使用该法大规模生产McAb成功的用于鼠-鼠、人-鼠或人-人杂交瘤.其方法是将杂交瘤细胞悬浮于藻酸钠溶液内,通过成滴装置使该细胞悬浮滴入CaCl2溶液中形成凝胶小球,细胞被固定化.先用L-赖氨酸洗涤,再用聚乙烯按溶液在界面形成半渗透膜.将次微球悬浮于液体培养基中,应厌恶和废物可通过微囊的膜,分泌的McAb则累积在微囊内.培养一段时间后,从培养基中分离出微球,冲洗微球后打开囊膜,离心分离集合获得高浓度的McAb.该法比悬浮培养法更好,前者产量为90ug/106个细胞,后者仅为100—200ng/106个细胞;前者纯度为总蛋白的52%,后者则不到1%;1000L培养基即可生产1kgMcAb,相当于5万只小鼠的产量.其优点:a、从微囊中收集上网McAb含量高,可使人McAb的产量提高30—100倍,纯度也比其他方法高,且提纯程序简单,成本极低;b、扩大了杂交瘤细胞贴附表面积,发酵罐容量和培养基的需要量相对减少,工厂占地面积也随之减少,Damon Biotech公司年产数千克的McAb,二新厂房面积只有464.5m2工作人员仅15—20人.
为了大量制备McAb,可采用装有搅拌器或气泡搅拌装置的250L、500L、1000L发酵罐体外大量培养杂交瘤细胞.这种大罐悬浮培养的优点是易于操作.也有人改用一种连续灌注的培养系统,罐内放置一块10μm滤片,用于截留细胞,其细胞生长浓度比常规培养高10倍以上[(1～2)×107个/ml]由于不断加入新鲜培养基,所以滤液的McAb浓度可提高10倍以上,达到500ug/ml水平.
Amicon公司采用Vitafiber中空纤维组成的超滤系统,在大罐内装有中空纤维(其膜的截留阀为1～5万道尔顿)组成的超滤装置,在超滤膜外室间培养细胞,培养基通过中空纤维不断循环,依此膜交换细胞的营养物质和废物.在此培养系统中可使杂交瘤细胞生长浓度高达108个/ml,培养基中McAb浓度可达6mg/ml,其中血清含量仅需用1%～2%,不仅可降低血清消耗的成本,而且血清含量低,也利于纯化.此法生产的McAb纯度比腹水中McAb高两个数量级.
采用无血清培养基培养杂交瘤细胞所产生的McAb,利于McAb的提纯.该培养基可以根据无血清培养基的配方自行配制,也可从市场上购置已配制好的无血清培养基.
工艺流程中配料罐1内配制培养基,经无菌过滤后送入储罐2,灭菌后送入平衡罐3,调整氧化还原电位至75～100mV,以提高细胞繁殖速度及生长密度,可再输入种子罐4和主培养罐5,也可供培养罐换液也扩大培养时使用.细胞先在种子罐中培养达饱和密度或对数生长期时,由4号罐将大部分细胞打入5好罐,再由3号罐加液至4号、5号罐,种子罐继续保种,主培养罐可进行生产,由5号罐培养的细胞达到生产目的后,细胞悬液进如收集罐6,经离心机7离心,收集细胞、上清(8号罐),上清若为目的产品液可收集提取产品,若纯属代谢废物也可作废物处理后排放,此系统中各部件均用带软管的快速接头构成直接连接系统,使设备之间均能及时分离和灭菌,此外种子罐与主培养罐系统均需配备检测温度.搅拌温度、CO2/O2、氧分压、pH值等的装置和自动控制,以检测和控制培养过程中的温度、压力、溶解氧、CO2浓度、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成分以及细胞密度等参数.
动物组织中的细胞密度约为109个/ml,为自然界细胞所处最高密度状态,哦体外悬浮培养的细胞密度一般在5x106个/ml以下,要提高细胞产量,需扩大培养规模,规模越大则控制越困难.现采用灌流培养法是较为有前途的技术,其流程包括培养基供给,培养罐、细胞及培养基分离系统,培养基连续收集装置,在上述检测和控制系统的下,细胞密度可达107个/ml,为一般悬浮培养法的10—100倍,更重要的是培养容量甚至可放大100—1000倍.
动物细胞生产不如微生物快,而且又具有贴壁依赖性,容易聚集成团,因此培养时为严格控制和防止污染,除反应器密封性能良好外,尚需添加抗生素,而且培养装置等接头处的材料应为无毒性物质.起温度、溶解氧、pH值变化对细胞生长影响明显,性强,要求控制系统灵敏、精密.通气量和搅拌速度快堆细胞不仅有机械损伤,而且有气泡产生而影响细胞生长.若加入抗泡沫剂,有可能有毒性,应尽量不加.通常控制一定气量和搅拌速度,通过改变空气中氧浓度来控制溶氧量,pH值常通过加入NaHCO3或通入CO2来进行调节.
最新评论